10. Průkaz žíhaného lemu resorpčního epitelu. Příprava a použití Bouinovy tekutiny

10. Průkaz žíhaného lemu resorpčního epitelu.
Příprava a použití Bouinovy tekutiny

Průkaz žíhaného lemu resorpčního epitelu
- Resorpční epitel obsahuje alkalickou fosfatázu, proto se dá prokázat metodou na průkaz alkalické fosfatázy


Alkalická fosfatáza
PRINCIP: Působením enzymu se ze substrátu (sloučeniny naftolu) odštěpí naftol, který reaguje s diazoniovou solí (stabilizovaným diazotátem) vznikem barevné, ve vodě nerozpustné sraženiny - azobarviva. Výhodou této reakce je, že se naftoly v těle nevyskytují, proto je reakce specifická.

1) Deparafinace X1, X2, aceton1, aceton2 3 – 5 minut, oplach řezů v dest. vodě
2) Inkubace 20 – 30 minut při 37°C Inkubační roztok: veronalacetátový pufr pH 9,1 …1 díl 20ml substrát - alfa - naftil fosfát diazotovaná sůl FAST RED TR alfa smísit, přefiltrovat
3) Oplach v dest. vodě, hematoxylin 2 minuty, dobarvení jader pramenitou vodou
4) Montování do medií rozpustných ve vodě; pokud chceme řezy uchovat delší dobu je vhodná glycerinová želatina – tuhne při pokojové teplotě

VÝSLEDEK BARVENÍ
Hnědočervené azobarvivo vznikne v místě výskytu alkalické fosfatázy

- Nachází se zde také glykoproteiny- glykokalix, proto slouží k jeho průkazu také PAS – reakce


PAS reakce
- metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů a polysacharidů
PRINCIP: Oxidací kyselinou jodistou se z polysacharidů uvolní aldehydické skupiny, které reagují s Schiffovým reagens vznikem růžovo - červeného zbarvení.
Schiffovo reagens – 200ml vařící dest. vody, rozpustí se v ní 1g bazického fuchsinu, ochladit na 50°C, přidat 20ml 1mol HCl, ochladit na 25°C, 2g disiřičitanu sodného nebo draselného, nechat stát 24 hodin v temnu v uzavřené nádobě, přidat 2g aktivního uhlí (slouží k odstranění nečistot) protřepat a zfiltrovat

1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) 1% kyselina jodistá 5 minut, praní ve vodě 10 minut
3) Schiffovo reagens 5 – 20 minut v temnu, praní ve vodě 10 minut
4) Harrisův hematoxylin 3 – 5 minut, oplach vodou 5 minut
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování

VÝSLEDEK BARVENÍ
PAS+ substance (glykogen, neutrální mukopolysacharidy, mukoproteiny) – purpurově červeně
Jádra – modře


Alciánová modř
- Metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů (např. na průkaz hlenu v pohárkových buňkách...)

1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování

VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně


Příprava a použití Bouinovy tekutiny
Patří do skupiny fixačních tekutin s kyselinou pikrovou. Obsahuje 1 díl formolu + 3 díly vodného nasyceného roztoku kyseliny pikrové, na 100 ml zásobního roztoku se přidává 5 ml ledové kyseliny octové. Tekutina má žlutou barvu a tuto barvu získává i tkáň, která je v ní fixována. Doba fixace je přibližně 24 hodin.
Nepoužívá se pro fixaci tkání, které obsahují velké množství krve, protože krev hemolyzuje, tvoří hrudky a tkáň se špatně krájí. Také se nepoužívá pro fixaci tkání, které chceme zalévat do celoidinu, protože kyselina pikrová zabraňuje pronikání celoidinu do tkáně.
Po fixaci se tkáň vkládá do 80 % alkoholu. Nepropírá se ve vodě, protože by došlo k bobtnání vaziva a tkáň by se špatně krájela.