25. Průkaz lipidů v játrech.
Montovací média a jejich výběr
Průkaz lipidů v játrech
1) Destilovaná voda – oplach
2) Oplach 50% alkoholem
3) Olejová červeň nebo sudanová modř – 15 – 30 min
4) (oplach 50% alkoholem), dest. voda
5) Dobarvení jader Harrisovým hematoxylinem (u olejové červeně) – 10 min, oplach ve vodě (modrání jader)
jádrová červeň (sudanová modř) – 10 min, oplach v dest. vodě
6) montování do glycerinové želatiny
VÝSLEDEK BARVENÍ
Tuk – červeně (olejová červeň)
černě (sudanová čerň)
Jádra – modře (hematoxylin)
červeně (jádrová červeň)
Montovací média a jejich výběr
Obarvené řezy montujeme mezi podložní a krycí sklíčko do montovacího média. Montovací médium musí být látka dokonale průhledná, nesmí poškozovat zbarvení tkáně a musí mít vysoký index lomu světla.
Dělí se do dvou skupin:
1. Nerozpustné ve vodě
- do těchto medií se řezy nemohou montovat přímo, nejprve se musí odvodnit v alkoholu a karbolxylenu a projasnit v xylenu
a) Kanadský balzám – pryskyřice kanadské jedle, hustý sirupovitý roztok, pokud je příliš hustý ředí se xylenem, pH má být neutrální; viskozita taková, aby se snadno odstranily vzduchové bubliny a současně, aby médium vtékalo mezi krycí a podložní sklo; tuhne delší dobu
b) Solakryl BMX – vyráběn synteticky, dodáván v tekoucím stavu, rozpustný v xylenu; montování může být buď s použitím krycího skla nebo bez použití krycího skla; preparát vyjmeme z kyvety s xylenem, otřeme přebytečný xylen a ještě vlhký řez překryjeme solakrylem, který zaschne do 10 minut a úplně ztvrdne do 30 minut
c) Entellan firmy MERCK – pro preparáty vyžadující přísně neutrální prostředí
d) Pertex
e) Merkoglass – tekuté krycí sklo (cytologie)
2. Rozpustné ve vodě
- řezy uzavíráme přímo z vody bez odvodnění; např. průkaz lipidů a enzymů
a) Glycerinová želatina – za pokojové teploty pevného skupenství před použitím ji rozpustíme na vodní lázni
b) Sirup z arabské gumy (Apáthyho sirup) – před použitím rozpustíme na vodní lázni; nevýhoda: při montování vzniknou snadno vzduchové bubliny
c) Levulózový sirup – levulóza se rozpustí v dest. vodě, odpařuje se na vodní lázni, až nabude konzistence hustého sirupu
d) Glycerin – nevýhoda: snadno dojde ke stržení krycího skla a preparáty poměrně brzy vyschnou
24. Massonovy trichromy, provedení barvení
24. Massonovy trichromy, provedení barvení
Zelený nichrom
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu světlá zeleň – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – zeleně
Svalstvo – červeně
Modrý nichrom
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu anilinová modř – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – modře
Svalstvo – červeně
Zelený nichrom
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu světlá zeleň – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – zeleně
Svalstvo – červeně
Modrý nichrom
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu anilinová modř – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – modře
Svalstvo – červeně
23. Znázornění žírných buněk ve vazivu. Zalévací media nerozpustná ve vodě
23. Znázornění žírných buněk ve vazivu.
Zalévací media nerozpustná ve vodě
Znázornění žírných buněk ve vazivu
- Žíhaný lem se dá prokázat alciánovou modří
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně
Zalévací media nerozpustná ve vodě
Zalévací media nerozpustná ve vodě se dělí na měkká (parafín) a tvrdá (celoidin)
- Parafín
Parafin je měkké médium nerozpustné ve vodě. Je to nejpoužívanější zalévací médium.
PRINCIP: Parafin pronikne do tkáně, vyplní všechny mikroskopické prostory a vytvoří s tkání jednolitou hmotu, která se dá dobře krájet.
POSTUP: Protože je parafin médium nerozpustné ve vodě, musí se nejprve tkáň prosytit rozpouštědlem parafinu.
1) Fixace - pro zalévání do parafinu se může použít jakákoliv fixační tekutina
2) Odvodnění - tkáň se musí zbavit veškeré vody, aby mohla být prosycena rozpouštědlem parafinu; odvodnění se provádí řadou alkoholů o stoupající koncentraci (viz. otázka č. 2)
3) Prosycování tkáně rozpouštědlem parafinu - jako rozpouštědla parafinu se používají:
a) látky s nižším bodem varu (benzen, xylen, toluen) - jsou to organická rozpouštědla, působí škodlivě na nervovou soustavu; odvodňování v těchto látkách provádíme ve třech lázních po 15 minutách (nemělo by probíhat déle než hodinu, protože potom tkáň tvrdne); protože jsou to látky s vysokým indexem lomu světla, dochází k projasnění tkáně, v místech kde ve tkáni zůstala voda, nedojde k projasnění, tato místa budou matná, u této tkáně musíme dokončit odvodnění v absolutním alkoholu
b) látky s vyšším bodem varu (metylbenzolát, metylsalycilát) - mají vysokou hustotu, proto do tkáně pronikají pomalu; odvodňování se provádí také ve třech lázních (1. 2 - 4 hod. , 2. 6 - 8 hod , 3. 8 - 12 hod.); po vložení tkáně do tohoto rozpouštědla, vzorek plave, po prosycení klesne na dno, protože je prosycen látkou s vyšší hustotou; tkáň po odvodnění projasní
4) Prosycení tkáně parafinem - aby se parafin dostal do tkáně, musí být v tekutém stavu, proto se prosycování provádí za tepla; bod tání parafinu je obvykle 50 - 60 °C (lepší je použít parafin s nižším bodem varu, aby se tkáň neporušila delším pobytem ve vysoké teplotě); tkáň se prosycuje ve třech lázních parafinu (parafin vytěsňuje rozpouštědlo a proniká do tkáně - lázeň parafinu se tak rozpouštědlem znečisťuje, proto se lázně musí vyměňovat); doba prosycování v jednotlivých lázních: 1. 6 hod, 2. 8 hod., 3. 12 hod.; tkáňové bločky přendaváme z jedné lázně do druhé nahřátou pinzetou, aby na ní netuhl parafin
5) Vlastní zalití do parafinu - přečištěný, tekutý parafin se nalije do zalévací komůrky; do ní vložíme tkáňový bloček prosycený parafinem, řeznou plochou na dno
6) Tmelení parafinových bločků - po ztuhnutí parafinu, se vyjme ze zalévací komůrky a nahřátým nožem se vykrojí tkáňový bloček (kolem tkáně se nechávají asi 0,5 cm okraje); tkáň se přitmelí na dřevěný špalíček, na který se dá nejprve tekutý parafin, přiloží se bloček a nahřátým nožem se objedou hrany bločku; bloček se označí
- Celoidin
Celoidin je tvrdé zalévací médium nerozpustné ve vodě.
- je to nitrát celulózy, suchý celoidin má vatovou strukturu - proceloidin, před použitím se musí rozpustit alkoholetherem na 10 % koncentraci
- proceloidin je výbušnina, nesmí se pracovat s otevřeným ohněm
POSTUP:
1) Fixace
- používá se jakákoliv fixační tekutina, kromě Buenovy tekutiny, protože kyselina pikrová v ní obsažená, brání pronikání celoidinu do tkáně
2) Odvodňování tkáňového bločku
- řadou alkoholů se stoupající koncentrací
70% - 2 hodiny
80% - 4-6 hodin
96% - 6 hodin
100% - 3x 2 hodiny
3) Prosycování rozpouštědlem celoidinu
- rozpouštědlem celoidinu je alkoholether (směs absolutního alkoholu a etheru v poměru 1 : 1)
- provádí se v dobře uzavřené nádobě, při pokojové teplotě 8 - 12 hodin
4) Prosycování tkáně celoidinem
- tkáň se prosycuje třemi koncentracemi celoidinu (2,5 % , 5 % a 10 %)
- provádí se v dobře uzavřené nádobce, aby neunikal ether, tím by se zvyšovala koncentrace a mohl by vzniknout až suchý celoidin
a) prosycování 2,5 % celoidinem - 24 hodin - 3 dny
b) prosycování 5 % celoidinem - 3 - 7 dní
c) prosycování 10 % celoidinem - 1 - 4 týdny
5) Vlastní zalití do celoidinu
- do skleněné nádobky s plochým dnem nalijeme 10 % celoidin
- celoidinu musí být dostatečné množství, protože při tuhnutí se jeho objem snižuje až o polovinu
- bloček zalitý do celoidinu přeneseme do nádobky - řeznou plochou na dno
- nejprve nádobku na několik hodin uzavřeme, aby mohli unikat bublinky
- poté ji mírně pootevřeme a necháme pomalu unikat ether, aby celoidin tuhl rovnoměrně
- zalévání se provádí v exsikátoru, kde je hygroskopická látka, aby se celoidin nemísil s vodou
- po ztuhnutí celoidinu se vykrojí celoidinový bloček, který se ukládá v 70 % alkoholu, aby nevysychal
6) Krájení
- krájí se na sáňkovém mikrotomu, šikmo nastaveným nožem
- při krájení se potírá v 70 % alkoholem, ve kterém se ukládají také řezy
Použití
- běžně se nepoužívá, protože doba zalévání je příliš dlouhá
- používá se pro zalévání tvrdých tkání (zub, kost, zvápenatělá chrupavka, šlacha), tyto tkáně by se špatně krájely v parafinu.
Zalévací media nerozpustná ve vodě
Znázornění žírných buněk ve vazivu
- Žíhaný lem se dá prokázat alciánovou modří
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně
Zalévací media nerozpustná ve vodě
Zalévací media nerozpustná ve vodě se dělí na měkká (parafín) a tvrdá (celoidin)
- Parafín
Parafin je měkké médium nerozpustné ve vodě. Je to nejpoužívanější zalévací médium.
PRINCIP: Parafin pronikne do tkáně, vyplní všechny mikroskopické prostory a vytvoří s tkání jednolitou hmotu, která se dá dobře krájet.
POSTUP: Protože je parafin médium nerozpustné ve vodě, musí se nejprve tkáň prosytit rozpouštědlem parafinu.
1) Fixace - pro zalévání do parafinu se může použít jakákoliv fixační tekutina
2) Odvodnění - tkáň se musí zbavit veškeré vody, aby mohla být prosycena rozpouštědlem parafinu; odvodnění se provádí řadou alkoholů o stoupající koncentraci (viz. otázka č. 2)
3) Prosycování tkáně rozpouštědlem parafinu - jako rozpouštědla parafinu se používají:
a) látky s nižším bodem varu (benzen, xylen, toluen) - jsou to organická rozpouštědla, působí škodlivě na nervovou soustavu; odvodňování v těchto látkách provádíme ve třech lázních po 15 minutách (nemělo by probíhat déle než hodinu, protože potom tkáň tvrdne); protože jsou to látky s vysokým indexem lomu světla, dochází k projasnění tkáně, v místech kde ve tkáni zůstala voda, nedojde k projasnění, tato místa budou matná, u této tkáně musíme dokončit odvodnění v absolutním alkoholu
b) látky s vyšším bodem varu (metylbenzolát, metylsalycilát) - mají vysokou hustotu, proto do tkáně pronikají pomalu; odvodňování se provádí také ve třech lázních (1. 2 - 4 hod. , 2. 6 - 8 hod , 3. 8 - 12 hod.); po vložení tkáně do tohoto rozpouštědla, vzorek plave, po prosycení klesne na dno, protože je prosycen látkou s vyšší hustotou; tkáň po odvodnění projasní
4) Prosycení tkáně parafinem - aby se parafin dostal do tkáně, musí být v tekutém stavu, proto se prosycování provádí za tepla; bod tání parafinu je obvykle 50 - 60 °C (lepší je použít parafin s nižším bodem varu, aby se tkáň neporušila delším pobytem ve vysoké teplotě); tkáň se prosycuje ve třech lázních parafinu (parafin vytěsňuje rozpouštědlo a proniká do tkáně - lázeň parafinu se tak rozpouštědlem znečisťuje, proto se lázně musí vyměňovat); doba prosycování v jednotlivých lázních: 1. 6 hod, 2. 8 hod., 3. 12 hod.; tkáňové bločky přendaváme z jedné lázně do druhé nahřátou pinzetou, aby na ní netuhl parafin
5) Vlastní zalití do parafinu - přečištěný, tekutý parafin se nalije do zalévací komůrky; do ní vložíme tkáňový bloček prosycený parafinem, řeznou plochou na dno
6) Tmelení parafinových bločků - po ztuhnutí parafinu, se vyjme ze zalévací komůrky a nahřátým nožem se vykrojí tkáňový bloček (kolem tkáně se nechávají asi 0,5 cm okraje); tkáň se přitmelí na dřevěný špalíček, na který se dá nejprve tekutý parafin, přiloží se bloček a nahřátým nožem se objedou hrany bločku; bloček se označí
- Celoidin
Celoidin je tvrdé zalévací médium nerozpustné ve vodě.
- je to nitrát celulózy, suchý celoidin má vatovou strukturu - proceloidin, před použitím se musí rozpustit alkoholetherem na 10 % koncentraci
- proceloidin je výbušnina, nesmí se pracovat s otevřeným ohněm
POSTUP:
1) Fixace
- používá se jakákoliv fixační tekutina, kromě Buenovy tekutiny, protože kyselina pikrová v ní obsažená, brání pronikání celoidinu do tkáně
2) Odvodňování tkáňového bločku
- řadou alkoholů se stoupající koncentrací
70% - 2 hodiny
80% - 4-6 hodin
96% - 6 hodin
100% - 3x 2 hodiny
3) Prosycování rozpouštědlem celoidinu
- rozpouštědlem celoidinu je alkoholether (směs absolutního alkoholu a etheru v poměru 1 : 1)
- provádí se v dobře uzavřené nádobě, při pokojové teplotě 8 - 12 hodin
4) Prosycování tkáně celoidinem
- tkáň se prosycuje třemi koncentracemi celoidinu (2,5 % , 5 % a 10 %)
- provádí se v dobře uzavřené nádobce, aby neunikal ether, tím by se zvyšovala koncentrace a mohl by vzniknout až suchý celoidin
a) prosycování 2,5 % celoidinem - 24 hodin - 3 dny
b) prosycování 5 % celoidinem - 3 - 7 dní
c) prosycování 10 % celoidinem - 1 - 4 týdny
5) Vlastní zalití do celoidinu
- do skleněné nádobky s plochým dnem nalijeme 10 % celoidin
- celoidinu musí být dostatečné množství, protože při tuhnutí se jeho objem snižuje až o polovinu
- bloček zalitý do celoidinu přeneseme do nádobky - řeznou plochou na dno
- nejprve nádobku na několik hodin uzavřeme, aby mohli unikat bublinky
- poté ji mírně pootevřeme a necháme pomalu unikat ether, aby celoidin tuhl rovnoměrně
- zalévání se provádí v exsikátoru, kde je hygroskopická látka, aby se celoidin nemísil s vodou
- po ztuhnutí celoidinu se vykrojí celoidinový bloček, který se ukládá v 70 % alkoholu, aby nevysychal
6) Krájení
- krájí se na sáňkovém mikrotomu, šikmo nastaveným nožem
- při krájení se potírá v 70 % alkoholem, ve kterém se ukládají také řezy
Použití
- běžně se nepoužívá, protože doba zalévání je příliš dlouhá
- používá se pro zalévání tvrdých tkání (zub, kost, zvápenatělá chrupavka, šlacha), tyto tkáně by se špatně krájely v parafinu.
22. Znázornění kolagenních vláken. Přehled metod a provedení vybrané metody
22. Znázornění kolagenních vláken. Přehled metod a provedení vybrané metody
Zelený nichrom
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu světlá zeleň – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – zeleně
Svalstvo – červeně
Modrý nichrom
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu anilinová modř – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – modře
Svalstvo – červeně
Zelený nichrom
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu světlá zeleň – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – zeleně
Svalstvo – červeně
Modrý nichrom
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu anilinová modř – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – modře
Svalstvo – červeně
21. Znázornění mitochondrií. Přehled a použití cytologických metod
21. Znázornění mitochondrií. Přehled a použití cytologických metod
Znázornění mitochondrií
Mitochondrie se dají znázornit základní cytologickou metodou – Heidenhainovou metodou
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve dest. vodě – 5 minut
2) Moření v 2,5% kamenci železitém (síran železito amonný) - 24 hodin (20 minut ve škole), oplach dest. vodě
3) Alkoholický roztok hematoxylinu – 24 hodin (20 minut ve škole), oplach v dest. vodě
4) Diferenciace ve 2,5% kamenci železitém (zčernání jader a plazma šedá)
5) Praní v pramenité vodě – 15 minut
6) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jaderný chromatin, mitochondrie, sekreční granula – modročerně až hnědočerně
Přehled a použití cytologických metod
Cytologické metody slouží k průkazu:
1. Základních cytologických struktur
- mitochondrie, centrioly, jadérka, jaderný chromatin
- dají se prokázat Hiedenhainovým barvením
2. Produktů metabolismu
- např. PAS-reakce
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) 1% kyselina jodistá 5 minut, praní ve vodě 10 minut
3) Schiffovo reagens 5 – 20 minut v temnu, praní ve vodě 10 minut
4) Harrisův hematoxylin 3 – 5 minut, oplach vodou 5 minut
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
PAS+ substance (glykogen, neutrální mukopolysacharidy, mukoproteiny) – purpurově červeně
Jádra – modře
Znázornění mitochondrií
Mitochondrie se dají znázornit základní cytologickou metodou – Heidenhainovou metodou
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve dest. vodě – 5 minut
2) Moření v 2,5% kamenci železitém (síran železito amonný) - 24 hodin (20 minut ve škole), oplach dest. vodě
3) Alkoholický roztok hematoxylinu – 24 hodin (20 minut ve škole), oplach v dest. vodě
4) Diferenciace ve 2,5% kamenci železitém (zčernání jader a plazma šedá)
5) Praní v pramenité vodě – 15 minut
6) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jaderný chromatin, mitochondrie, sekreční granula – modročerně až hnědočerně
Přehled a použití cytologických metod
Cytologické metody slouží k průkazu:
1. Základních cytologických struktur
- mitochondrie, centrioly, jadérka, jaderný chromatin
- dají se prokázat Hiedenhainovým barvením
2. Produktů metabolismu
- např. PAS-reakce
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) 1% kyselina jodistá 5 minut, praní ve vodě 10 minut
3) Schiffovo reagens 5 – 20 minut v temnu, praní ve vodě 10 minut
4) Harrisův hematoxylin 3 – 5 minut, oplach vodou 5 minut
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
PAS+ substance (glykogen, neutrální mukopolysacharidy, mukoproteiny) – purpurově červeně
Jádra – modře
20. Krájení, napínání a lepení parafinových řezů. Zalévací média rozpustná ve vodě – přehled a použití
20. Krájení, napínání a lepení parafinových řezů.
Zalévací média rozpustná ve vodě – přehled a použití
Krájení, napínání a lepení parafinových řezů
- Krájení
Může se provádět na rotačním i sáňkovém mikrotomu.
- Napínání a lepení
• Pomocí teplé destilované vody
do nádobky nalijeme teplou destilovanou vodu a na její hladinu položíme ukrojený řez; poté pomocí preparační jehly upevníme napnutý řez na podložní sklíčko natřené lepicí směsí; takto upravené řezy vložíme na 24 hodin do termostatu nastaveného na 37 - 40 °C
• Pomocí elektrické ploténky
na podložní sklíčko potřené lepicí směsí dáme kapku studené destilované vody, na kapku položíme ukrojený řez a sklíčko položíme na vyhřívanou ploténku; parafin se zahřívá pomalu, proto je napínání důkladnější, napínáme pomocí preparační jehlou; po vypnutí vložíme do termostatu
Lepení parafinových řezů je založeno na denaturaci bílkovin, přítomných v lepicí směsi, při vyšší teplotě 37-40°C (proto po napnutí vkládáme do termostatu)
Zalévací média rozpustná ve vodě – princip a použití
Média rozpustná ve vodě se dělí na měkká (želatina) a tvrdá (celodal).
- Želatina
želatina je měkké zalévací médium rozpustné ve vodě
používá se pro zalévání řídkých tkání, které chceme zpevnit, nebo pokud tkáň chceme uchovat delší dobu
želatina vytěsní z tkáně vodu, která je mezi buňkami
prosycení tkáňového bločku vypraného ve vodě postupně v koncentrátu želatiny při 37°C, pak se bloček zchladí, želatina ztuhne a bloček se stvrdí ve formolu, krájí se na zmrazovacím mikrotomu
POSTUP:
1) tkáňové bločky fixujeme formolem, vypereme v tekoucí vodě – 24 hodin
2) prosycování 10% roztokem želatiny při teplotě 37°C – 2 – 4 hodiny
3) prosycování 20% roztokem želatiny při 37°C – 4 – 6 hodin
4) zalití bločku do 20% roztoku želatiny do kovové nebo papírové krabičky
5) želatinu necháme ztuhnout
6) tvrzení želatinových bločků ve 20% formolu – 24 hodin
7) praní želatinových bločků ve vodě a krájení na zmrazovacím mikrotomu
Příprava roztoku želatiny
Roztok 10% - 20% želatiny se připraví rozpuštěním odváženého množství želatiny; želatinu necháme 15 minut zbobtnat a pak rozpustíme ve vodní lázni nebo termostatu za účelem konzervace přidáme krystalek thymolu.
Zalévací média rozpustná ve vodě – přehled a použití
Krájení, napínání a lepení parafinových řezů
- Krájení
Může se provádět na rotačním i sáňkovém mikrotomu.
- Napínání a lepení
• Pomocí teplé destilované vody
do nádobky nalijeme teplou destilovanou vodu a na její hladinu položíme ukrojený řez; poté pomocí preparační jehly upevníme napnutý řez na podložní sklíčko natřené lepicí směsí; takto upravené řezy vložíme na 24 hodin do termostatu nastaveného na 37 - 40 °C
• Pomocí elektrické ploténky
na podložní sklíčko potřené lepicí směsí dáme kapku studené destilované vody, na kapku položíme ukrojený řez a sklíčko položíme na vyhřívanou ploténku; parafin se zahřívá pomalu, proto je napínání důkladnější, napínáme pomocí preparační jehlou; po vypnutí vložíme do termostatu
Lepení parafinových řezů je založeno na denaturaci bílkovin, přítomných v lepicí směsi, při vyšší teplotě 37-40°C (proto po napnutí vkládáme do termostatu)
Zalévací média rozpustná ve vodě – princip a použití
Média rozpustná ve vodě se dělí na měkká (želatina) a tvrdá (celodal).
- Želatina
želatina je měkké zalévací médium rozpustné ve vodě
používá se pro zalévání řídkých tkání, které chceme zpevnit, nebo pokud tkáň chceme uchovat delší dobu
želatina vytěsní z tkáně vodu, která je mezi buňkami
prosycení tkáňového bločku vypraného ve vodě postupně v koncentrátu želatiny při 37°C, pak se bloček zchladí, želatina ztuhne a bloček se stvrdí ve formolu, krájí se na zmrazovacím mikrotomu
POSTUP:
1) tkáňové bločky fixujeme formolem, vypereme v tekoucí vodě – 24 hodin
2) prosycování 10% roztokem želatiny při teplotě 37°C – 2 – 4 hodiny
3) prosycování 20% roztokem želatiny při 37°C – 4 – 6 hodin
4) zalití bločku do 20% roztoku želatiny do kovové nebo papírové krabičky
5) želatinu necháme ztuhnout
6) tvrzení želatinových bločků ve 20% formolu – 24 hodin
7) praní želatinových bločků ve vodě a krájení na zmrazovacím mikrotomu
Příprava roztoku želatiny
Roztok 10% - 20% želatiny se připraví rozpuštěním odváženého množství želatiny; želatinu necháme 15 minut zbobtnat a pak rozpustíme ve vodní lázni nebo termostatu za účelem konzervace přidáme krystalek thymolu.
19. Krájení parafinových řezů na rotačním mikrotomu. Princip napínání a lepení parafínových řezů
19. Krájení parafinových řezů na rotačním mikrotomu.
Princip napínání a lepení parafínových řezů
Krájení parafinových řezů na rotačním mikrotomu
Rotační mikrotom slouží výhradně ke krájení parafinových bloků, zejména pro zhotovování sériových řezů. Mikrotomový nůž je umístěn v pevné svorce, proti němu se pohybuje otáčením setrvačníkového kola svorka s bločkem - pohybuje se nahoru a dolů a současně se posouvá dopředu o určitý počet mikrometrů, který je nastaven na mikrošroubu.
Krájení, napínání a lepení parafinových řezů
- Krájení
Může se provádět na rotačním i sáňkovém mikrotomu.
- Napínání a lepení
• Pomocí teplé destilované vody
do nádobky nalijeme teplou destilovanou vodu a na její hladinu položíme ukrojený řez; poté pomocí preparační jehly upevníme napnutý řez na podložní sklíčko natřené lepicí směsí; takto upravené řezy vložíme na 24 hodin do termostatu nastaveného na 37 - 40 °C
• Pomocí elektrické ploténky
na podložní sklíčko potřené lepicí směsí dáme kapku studené destilované vody, na kapku položíme ukrojený řez a sklíčko položíme na vyhřívanou ploténku; parafin se zahřívá pomalu, proto je napínání důkladnější, napínáme pomocí preparační jehlou; po vypnutí vložíme do termostatu
Lepení parafinových řezů je založeno na denaturaci bílkovin, přítomných v lepicí směsi, při vyšší teplotě 37-40°C (proto po napnutí vkládáme do termostatu)
Princip napínání a lepení parafínových řezů
Krájení parafinových řezů na rotačním mikrotomu
Rotační mikrotom slouží výhradně ke krájení parafinových bloků, zejména pro zhotovování sériových řezů. Mikrotomový nůž je umístěn v pevné svorce, proti němu se pohybuje otáčením setrvačníkového kola svorka s bločkem - pohybuje se nahoru a dolů a současně se posouvá dopředu o určitý počet mikrometrů, který je nastaven na mikrošroubu.
Krájení, napínání a lepení parafinových řezů
- Krájení
Může se provádět na rotačním i sáňkovém mikrotomu.
- Napínání a lepení
• Pomocí teplé destilované vody
do nádobky nalijeme teplou destilovanou vodu a na její hladinu položíme ukrojený řez; poté pomocí preparační jehly upevníme napnutý řez na podložní sklíčko natřené lepicí směsí; takto upravené řezy vložíme na 24 hodin do termostatu nastaveného na 37 - 40 °C
• Pomocí elektrické ploténky
na podložní sklíčko potřené lepicí směsí dáme kapku studené destilované vody, na kapku položíme ukrojený řez a sklíčko položíme na vyhřívanou ploténku; parafin se zahřívá pomalu, proto je napínání důkladnější, napínáme pomocí preparační jehlou; po vypnutí vložíme do termostatu
Lepení parafinových řezů je založeno na denaturaci bílkovin, přítomných v lepicí směsi, při vyšší teplotě 37-40°C (proto po napnutí vkládáme do termostatu)
18. Barvení Weigert van Giesonovou metodou. Příprava a použití fixačních prostředků s formolem
18. Barvení Weigert van Giesonovou metodou.
Příprava a použití fixačních prostředků s formolem
Barvení Weigert Van Giesnovou metodou
- Přehledná barvící metoda, slouží k průkazu kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin – 3 – 10 minut, oplach ve vodě, diferencování kyselým alkoholem, oplach ve vodě
3) (5% kyselina fosfowolframová – 5 minut, oplach v dest. vodě)
4) Pikrofuchsin – 3 -5 minut, oplach krátce v 80% alkoholu
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modročerně až hnědočerně
Kolagenní vazivo – třešňově červeně
Svalstvo – žlutě
Příprava a požití fixačních prostředků s formolem
FORMOL
40% roztok formaldehydu ve vodě; nejužívanější fixační tekutina, bezbarvá, dráždivého zápachu (dráždí sliznice, při styku s kůží způsobí ztvrdnutí pokožky, u citlivých osob může vyvolat exémy – rukavice); účinkem světla se oxiduje na k. mravenčí -> to má nepříznivý vliv na fixaci, proto v laboratoři má být uchován v lahvi z tmavého skla, ve které ve výši asi 2 cm je práškovaný CaCO3; k fixaci se užívá 10 – 20% formol;
100% formol = 40% formaldehyd
10% formol = 4% formaldehyd
20% formol = 8% formaldehyd
formol (reakce lehce zásaditá) se ředí vždy pramenitou vodou (reakce lehce kyselá)
Výhody - rychle proniká; tkáň se po něm dobře barví; při krátkodobé fixaci nerozpouští tuky a lipidy; tkáň dobře tvrdí a konzervuje
Nevýhody - Způsobuje určité bobtnání tkání, buňkám dodává sklovitého vzhledu, proto je lepší užívat formol neutrální; v krevnatých orgánech často vznikají rezavě hnědě zbarvené „formolové sraženiny“ odstraníme: praní bločků v 1% roztoku hydroxidu draselném v 80% alkoholu 5 hodin; praní ve vodě 1 hodinu; praní v 80% alkoholu, několikrát měněném; praní ve vodě; tkáň se fixuje formolem 24 – 48 hodin; po fixaci do 70% alkoholu nebo se pere 2 – 4 hodiny v pramenité vodě
- NEUTRÁLNÍ FORMOL
Do lahve s formolem nasypeme práškový uhličitan vápenatý nebo hořečnatý do výše 2 – 5 cm, občas protřepeme láhev, formol zneutralizován za několik dní, ředíme pramenitou vodou, koncentrace 10 – 20%
- BAKEROVA TEKUTINA
Neutrální formol + CaCl2 + pramenitá voda; vhodná pro průkaz lipidů nebo enzymů
- SLANÝ FORMOL
Jeden díl neutrálního formolu + 9 dílů fyziologického roztoku
- NEUTRÁLNÍ NÁRAZNÍKOVÝ FORMOL
neutrální formol, dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný (bezvodý); nárazník (pufr) udržuje určitou hodnotu pH
- BROMFORMOL
Neutrální formol + destilovaná voda + bromid amonný; k fixaci neuroglie
Příprava a použití fixačních prostředků s formolem
Barvení Weigert Van Giesnovou metodou
- Přehledná barvící metoda, slouží k průkazu kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin – 3 – 10 minut, oplach ve vodě, diferencování kyselým alkoholem, oplach ve vodě
3) (5% kyselina fosfowolframová – 5 minut, oplach v dest. vodě)
4) Pikrofuchsin – 3 -5 minut, oplach krátce v 80% alkoholu
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modročerně až hnědočerně
Kolagenní vazivo – třešňově červeně
Svalstvo – žlutě
Příprava a požití fixačních prostředků s formolem
FORMOL
40% roztok formaldehydu ve vodě; nejužívanější fixační tekutina, bezbarvá, dráždivého zápachu (dráždí sliznice, při styku s kůží způsobí ztvrdnutí pokožky, u citlivých osob může vyvolat exémy – rukavice); účinkem světla se oxiduje na k. mravenčí -> to má nepříznivý vliv na fixaci, proto v laboratoři má být uchován v lahvi z tmavého skla, ve které ve výši asi 2 cm je práškovaný CaCO3; k fixaci se užívá 10 – 20% formol;
100% formol = 40% formaldehyd
10% formol = 4% formaldehyd
20% formol = 8% formaldehyd
formol (reakce lehce zásaditá) se ředí vždy pramenitou vodou (reakce lehce kyselá)
Výhody - rychle proniká; tkáň se po něm dobře barví; při krátkodobé fixaci nerozpouští tuky a lipidy; tkáň dobře tvrdí a konzervuje
Nevýhody - Způsobuje určité bobtnání tkání, buňkám dodává sklovitého vzhledu, proto je lepší užívat formol neutrální; v krevnatých orgánech často vznikají rezavě hnědě zbarvené „formolové sraženiny“ odstraníme: praní bločků v 1% roztoku hydroxidu draselném v 80% alkoholu 5 hodin; praní ve vodě 1 hodinu; praní v 80% alkoholu, několikrát měněném; praní ve vodě; tkáň se fixuje formolem 24 – 48 hodin; po fixaci do 70% alkoholu nebo se pere 2 – 4 hodiny v pramenité vodě
- NEUTRÁLNÍ FORMOL
Do lahve s formolem nasypeme práškový uhličitan vápenatý nebo hořečnatý do výše 2 – 5 cm, občas protřepeme láhev, formol zneutralizován za několik dní, ředíme pramenitou vodou, koncentrace 10 – 20%
- BAKEROVA TEKUTINA
Neutrální formol + CaCl2 + pramenitá voda; vhodná pro průkaz lipidů nebo enzymů
- SLANÝ FORMOL
Jeden díl neutrálního formolu + 9 dílů fyziologického roztoku
- NEUTRÁLNÍ NÁRAZNÍKOVÝ FORMOL
neutrální formol, dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný (bezvodý); nárazník (pufr) udržuje určitou hodnotu pH
- BROMFORMOL
Neutrální formol + destilovaná voda + bromid amonný; k fixaci neuroglie
17. Znázornění myelinových pochev. Barvení luxolovou modří.
17. Znázornění myelinových pochev.
Barvení luxolovou modří.
Karbolxylen – příprava a použití
Znázornění myelinových pochev
- Myelinové pochvy obsahují fosfolipoproteiny, dají se znázornit barvením luxolovou modří
Barvení luxolovou modří
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, neoplachovat ve vodě
2) 0,1% Luxolová modř (Luxol Fast Blue MBS) v 95% alkoholu – 8 – 12 hodin při 58°C (asi hodinu)
3) Oplach v 96% alkoholu, diferencovat střídavě v 70% alkoholu a v 0,5% uhličitanu lithném, oplach v dest. vodě
4) Jádrová červeň – 10 minut, oplach v dest. vodě
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Fosfolipidy – modře
Jádra – červeně
Karbolxylen – příprava a použití
nasycený roztok fenolu v xylenu; fenol neboli karbol je krystalická látka, proto se nasycený roztok připraví tak, že do fenolu lijeme xylen, dokud se fenol nerozpustí
KX (karbolxylen) má silné hydroskopické účinky, pohlcuje vlhkost, proto se používá k odvodňování preparátů po dvou lázních alkoholu
Barvení luxolovou modří.
Karbolxylen – příprava a použití
Znázornění myelinových pochev
- Myelinové pochvy obsahují fosfolipoproteiny, dají se znázornit barvením luxolovou modří
Barvení luxolovou modří
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, neoplachovat ve vodě
2) 0,1% Luxolová modř (Luxol Fast Blue MBS) v 95% alkoholu – 8 – 12 hodin při 58°C (asi hodinu)
3) Oplach v 96% alkoholu, diferencovat střídavě v 70% alkoholu a v 0,5% uhličitanu lithném, oplach v dest. vodě
4) Jádrová červeň – 10 minut, oplach v dest. vodě
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Fosfolipidy – modře
Jádra – červeně
Karbolxylen – příprava a použití
nasycený roztok fenolu v xylenu; fenol neboli karbol je krystalická látka, proto se nasycený roztok připraví tak, že do fenolu lijeme xylen, dokud se fenol nerozpustí
KX (karbolxylen) má silné hydroskopické účinky, pohlcuje vlhkost, proto se používá k odvodňování preparátů po dvou lázních alkoholu
16. Průkaz hlenu v pohárkových buňkách. SUSA - příprava a použití
16. Průkaz hlenu v pohárkových buňkách.
SUSA - příprava a použití
Průkaz hlenu v pohárkových buňkách
- Hlen v pohárkových buňkách se skládá z kyselých mukopolysacharidů, proto se dá prokázat těmito metodami:PAS reakcí - pohárkové buňky se barví červeně, barvením alciánovou modří -barví se modře
PAS reakce
- metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů a polysacharidů
PRINCIP: Oxidací kyselinou jodistou se z polysacharidů uvolní aldehydické skupiny, které reagují s Schiffovým reagens vznikem růžovo - červeného zbarvení.
Schiffovo reagens – 200ml vařící dest. vody, rozpustí se v ní 1g bazického fuchsinu, ochladit na 50°C, přidat 20ml 1mol HCl, ochladit na 25°C, 2g disiřičitanu sodného nebo draselného, nechat stát 24 hodin v temnu v uzavřené nádobě, přidat 2g aktivního uhlí (slouží k odstranění nečistot) protřepat a zfiltrovat
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) 1% kyselina jodistá 5 minut, praní ve vodě 10 minut
3) Schiffovo reagens 5 – 20 minut v temnu, praní ve vodě 10 minut
4) Harrisův hematoxylin 3 – 5 minut, oplach vodou 5 minut
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
PAS+ substance (glykogen, neutrální mukopolysacharidy, mukoproteiny) – purpurově červeně
Jádra – modře
Alciánová modř
- Metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů (např. na průkaz hlenu v pohárkových buňkách...)
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně
SUSA – příprava a použití
Obsahuje sublimát – HgCl2 , NaCl, kys. trichloroctová, formol a destilovanou vodu; Používá se hlavně k fixaci tvrdých tkání (kost, zub, zvápenatělá chrupavka, šlacha); kyselina trichloroctová zde slouží jako dekalcifikační prostředek - tkáň se tak zbavuje části minerálů již při fixaci; Po fixaci tkáň vkládáme do alkoholu (pokud tkáň obsahuje málo vody, používá se 90 % alkohol, pokud obsahuje více vody, vkládá se do méně koncentrovaného alkoholu)v alkoholu se provádí jodování - tkáň se zbavuje sraženin sublimátu
SUSA - příprava a použití
Průkaz hlenu v pohárkových buňkách
- Hlen v pohárkových buňkách se skládá z kyselých mukopolysacharidů, proto se dá prokázat těmito metodami:PAS reakcí - pohárkové buňky se barví červeně, barvením alciánovou modří -barví se modře
PAS reakce
- metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů a polysacharidů
PRINCIP: Oxidací kyselinou jodistou se z polysacharidů uvolní aldehydické skupiny, které reagují s Schiffovým reagens vznikem růžovo - červeného zbarvení.
Schiffovo reagens – 200ml vařící dest. vody, rozpustí se v ní 1g bazického fuchsinu, ochladit na 50°C, přidat 20ml 1mol HCl, ochladit na 25°C, 2g disiřičitanu sodného nebo draselného, nechat stát 24 hodin v temnu v uzavřené nádobě, přidat 2g aktivního uhlí (slouží k odstranění nečistot) protřepat a zfiltrovat
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) 1% kyselina jodistá 5 minut, praní ve vodě 10 minut
3) Schiffovo reagens 5 – 20 minut v temnu, praní ve vodě 10 minut
4) Harrisův hematoxylin 3 – 5 minut, oplach vodou 5 minut
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
PAS+ substance (glykogen, neutrální mukopolysacharidy, mukoproteiny) – purpurově červeně
Jádra – modře
Alciánová modř
- Metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů (např. na průkaz hlenu v pohárkových buňkách...)
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně
SUSA – příprava a použití
Obsahuje sublimát – HgCl2 , NaCl, kys. trichloroctová, formol a destilovanou vodu; Používá se hlavně k fixaci tvrdých tkání (kost, zub, zvápenatělá chrupavka, šlacha); kyselina trichloroctová zde slouží jako dekalcifikační prostředek - tkáň se tak zbavuje části minerálů již při fixaci; Po fixaci tkáň vkládáme do alkoholu (pokud tkáň obsahuje málo vody, používá se 90 % alkohol, pokud obsahuje více vody, vkládá se do méně koncentrovaného alkoholu)v alkoholu se provádí jodování - tkáň se zbavuje sraženin sublimátu
15. Přehled neurohistologických metod. Provedení Nisslova barvení
15. Přehled neurohistologických metod.
Provedení Nisslova barvení
Přehled neurohistologických metod
- Neurohistologické metody se dají rozdělit na dvě skupiny - metody barevné a impregnační.
Barevné metody:
Barvení luxolovou modří
- slouží k znázornění myelinových pochev – fosfolipoproteinů
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, neoplachovat ve vodě
2) 0,1% Luxolová modř (Luxol Fast Blue MBS) v 95% alkoholu – 8 – 12 hodin při 58°C (asi hodinu)
3) Oplach v 96% alkoholu, diferencovat střídavě v 70% alkoholu a v 0,5% uhličitanu lithném, oplach v dest. vodě
4) Jádrová červeň – 10 minut, oplach v dest. vodě
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Fosfolipidy – modře
Jádra – červeně
a. Nisslova metod
- průkaz Nisslovy tigroidní substance (komplex granulárního endoplazmatického retikula)
Impregnační metody
jsou založené na prosycení tkáně solemi těžkých kovů, nejčastěji stříbra, které se redukují na nervových nebo neuroglyových vláknech v černě zbarvené stříbro
Provedení Nisslova barvení
6) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
7) 0,1% thionin nebo toluidinová modř – 30 minut při 37°C
8) Nechat řezy v barvě do vychladnutí, oplach v dest. vodě, diferencovat v 96% alkoholu
9) Odvodnění acetonem; projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Cytoplazma gangliových buněk – světle modře až fialově
Hrudky tigroidní substance a jadérka - tmavě fialově
Provedení Nisslova barvení
Přehled neurohistologických metod
- Neurohistologické metody se dají rozdělit na dvě skupiny - metody barevné a impregnační.
Barevné metody:
Barvení luxolovou modří
- slouží k znázornění myelinových pochev – fosfolipoproteinů
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, neoplachovat ve vodě
2) 0,1% Luxolová modř (Luxol Fast Blue MBS) v 95% alkoholu – 8 – 12 hodin při 58°C (asi hodinu)
3) Oplach v 96% alkoholu, diferencovat střídavě v 70% alkoholu a v 0,5% uhličitanu lithném, oplach v dest. vodě
4) Jádrová červeň – 10 minut, oplach v dest. vodě
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Fosfolipidy – modře
Jádra – červeně
a. Nisslova metod
- průkaz Nisslovy tigroidní substance (komplex granulárního endoplazmatického retikula)
Impregnační metody
jsou založené na prosycení tkáně solemi těžkých kovů, nejčastěji stříbra, které se redukují na nervových nebo neuroglyových vláknech v černě zbarvené stříbro
Provedení Nisslova barvení
6) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
7) 0,1% thionin nebo toluidinová modř – 30 minut při 37°C
8) Nechat řezy v barvě do vychladnutí, oplach v dest. vodě, diferencovat v 96% alkoholu
9) Odvodnění acetonem; projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Cytoplazma gangliových buněk – světle modře až fialově
Hrudky tigroidní substance a jadérka - tmavě fialově
14. Gomoriho impregnace. Příprava amoniakálního roztoku stříbra
14. Gomoriho impregnace.
Příprava amoniakálního roztoku stříbra
Gomoriho impregnace
- Gomoriho impregnace patří mezi impregnační metody, slouží k znázornění retikulárních vláken a používá se také v neurohistologii, k průkazu neuroglie a retikulárních vláken. Provádí se buď na parafinových řezech nebo na řezech krájených na zmrazovacím mikrotomu, k lepení parafinových řezů se používá 1 % želatina.
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) Oxidace 0,5% manganistan draselný - 3 – 5 minut, dest. voda
3) Bělení 2% disiřičitan draselný - 2 minuty, praní ve vodě – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Moření 2% kamenec železitý – 1 minuta, praní ve vodě – 5 minut, vyměňovaná voda – 5 minut
5) Amoniakální roztok stříbra – 1 minuta, krátký oplach v dest. vodě
6) Redukce 10% neutrální formol – 5 minut (při zkalení roztok vyměníme), oplach v dest. vodě
7) Zlacení 0,1% chlorid zlatitý – 10 – 15 minut, oplach v dest. vodě
8) Fixace 1% thiosíran sodný - 1 minuta, praní ve vodě – 5 minut, oplach v dest. vodě
9) Jádrová červeň - 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
10) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Retikulární vlákna – černě
Kolagenní vazivo – šedohnědě
Jádra – červeně
Příprava amoniakálního roztoku stříbra
10% dusičnan stříbrný + 10% hydroxid sodný
vznikne sraženina, přidáváme po kapkách amoniak, za stálého třepání do rozpuštění sraženiny, potom přidáme po kapkách 10% dusičnan stříbrný, po každé kapce tekutinu protřepáme, přidáváme tak dlouho dokud se rozpouští a roztok zůstane opalescenční; roztok se doplní dest. vodou do 100ml
Příprava amoniakálního roztoku stříbra
Gomoriho impregnace
- Gomoriho impregnace patří mezi impregnační metody, slouží k znázornění retikulárních vláken a používá se také v neurohistologii, k průkazu neuroglie a retikulárních vláken. Provádí se buď na parafinových řezech nebo na řezech krájených na zmrazovacím mikrotomu, k lepení parafinových řezů se používá 1 % želatina.
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) Oxidace 0,5% manganistan draselný - 3 – 5 minut, dest. voda
3) Bělení 2% disiřičitan draselný - 2 minuty, praní ve vodě – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Moření 2% kamenec železitý – 1 minuta, praní ve vodě – 5 minut, vyměňovaná voda – 5 minut
5) Amoniakální roztok stříbra – 1 minuta, krátký oplach v dest. vodě
6) Redukce 10% neutrální formol – 5 minut (při zkalení roztok vyměníme), oplach v dest. vodě
7) Zlacení 0,1% chlorid zlatitý – 10 – 15 minut, oplach v dest. vodě
8) Fixace 1% thiosíran sodný - 1 minuta, praní ve vodě – 5 minut, oplach v dest. vodě
9) Jádrová červeň - 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
10) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Retikulární vlákna – černě
Kolagenní vazivo – šedohnědě
Jádra – červeně
Příprava amoniakálního roztoku stříbra
10% dusičnan stříbrný + 10% hydroxid sodný
vznikne sraženina, přidáváme po kapkách amoniak, za stálého třepání do rozpuštění sraženiny, potom přidáme po kapkách 10% dusičnan stříbrný, po každé kapce tekutinu protřepáme, přidáváme tak dlouho dokud se rozpouští a roztok zůstane opalescenční; roztok se doplní dest. vodou do 100ml
13. Průkaz glykogenu. Zenkerova tekutina, příprava a použití
13. Průkaz glykogenu.
Zenkerova tekutina, příprava a použití
Průkaz glykogenu
- Glykogen je polysacharid, který se dá rozštěpit pomocí enzymů - amylázy, diastázy a ptyalinu (tyto enzymy jsou přítomny také ve slinách)
Na průkaz glykogenu se používá PAS reakce s kontrolou
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Kontrolní řez se nechá inkubovat při pokojové teplotě v 1% roztoku diastázy – 30 minut, místo diastázy lze použít slin, vyprat dobře v dest. vodě
3) PAS reakce s dobarvením Hurisovým hematoxylinem
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
pokud sacharid, který je ve tkání, je glykogen - je PAS reakce na pokusném řezu negativní a na kontrolním řezu pozitivní, protože se glykogen v pokusném řezu rozštěpil enzymem
pokud je ve tkáni jiný sacharid než glykogen, je PAS reakce na obou řezech pozitivní (ve tkáni se nachází nějaký diastázorezistentní polysacharid)
Zenkerova tekutina
Sublimát + síran sodný + dvojchroman draselný + dest. voda
Před použitím na 100ml přidat 5ml ledové kyseliny octové
Zenkerova tekutina má sytě oranžovohnědou barvu, kterou způsobuje dvojchroman draselný, způsobuje silné zabarvení tkáně, proto se tkáň po fixaci propírá v tekoucí vodě v promývací nádobce (24 hodin)
Po vyprání se tkáň vkládá do 70 % alkoholu, ve kterém se provádí jodování - jodováním se z tkáně odstraní sublimátové sraženiny (jodování je možné provádět hned po fixaci - jodování v bločku, nebo až při deparafinaci v poslední lázni alkoholu - jodování v řezech - trvá jen několik minut)
Postup jodování:
Sublimát se v tkáni ukládá jako nerozpustná sraženina, odstraňuje se pomocí jodové tinktury nebo Lugolova roztoku. Jod se váže na sublimát a tvoří s ním rozpustnou látku, která přechází do roztoku. Pokud je ve tkáni sublimát, reaguje s ním jod a roztok se odbarvuje, pokud již ve tkáni není sublimát, roztok se obarví jodem.
Zenkerova tekutina, příprava a použití
Průkaz glykogenu
- Glykogen je polysacharid, který se dá rozštěpit pomocí enzymů - amylázy, diastázy a ptyalinu (tyto enzymy jsou přítomny také ve slinách)
Na průkaz glykogenu se používá PAS reakce s kontrolou
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Kontrolní řez se nechá inkubovat při pokojové teplotě v 1% roztoku diastázy – 30 minut, místo diastázy lze použít slin, vyprat dobře v dest. vodě
3) PAS reakce s dobarvením Hurisovým hematoxylinem
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
pokud sacharid, který je ve tkání, je glykogen - je PAS reakce na pokusném řezu negativní a na kontrolním řezu pozitivní, protože se glykogen v pokusném řezu rozštěpil enzymem
pokud je ve tkáni jiný sacharid než glykogen, je PAS reakce na obou řezech pozitivní (ve tkáni se nachází nějaký diastázorezistentní polysacharid)
Zenkerova tekutina
Sublimát + síran sodný + dvojchroman draselný + dest. voda
Před použitím na 100ml přidat 5ml ledové kyseliny octové
Zenkerova tekutina má sytě oranžovohnědou barvu, kterou způsobuje dvojchroman draselný, způsobuje silné zabarvení tkáně, proto se tkáň po fixaci propírá v tekoucí vodě v promývací nádobce (24 hodin)
Po vyprání se tkáň vkládá do 70 % alkoholu, ve kterém se provádí jodování - jodováním se z tkáně odstraní sublimátové sraženiny (jodování je možné provádět hned po fixaci - jodování v bločku, nebo až při deparafinaci v poslední lázni alkoholu - jodování v řezech - trvá jen několik minut)
Postup jodování:
Sublimát se v tkáni ukládá jako nerozpustná sraženina, odstraňuje se pomocí jodové tinktury nebo Lugolova roztoku. Jod se váže na sublimát a tvoří s ním rozpustnou látku, která přechází do roztoku. Pokud je ve tkáni sublimát, reaguje s ním jod a roztok se odbarvuje, pokud již ve tkáni není sublimát, roztok se obarví jodem.
12. Barvení alciánovou modří. Zalévání do parafinu, princip a použití metody
12. Barvení alciánovou modří.
Zalévání do parafinu, princip a použití metody
Barvení alciánovou modří
- Metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů (např. na průkaz hlenu v pohárkových buňkách...)
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně
Zalévání do parafinu, princip a použití metody
Parafin je měkké médium nerozpustné ve vodě. Je to nejpoužívanější zalévací médium.
PRINCIP: Parafin pronikne do tkáně, vyplní všechny mikroskopické prostory a vytvoří s tkání jednolitou hmotu, která se dá dobře krájet.
POSTUP: Protože je parafin médium nerozpustné ve vodě, musí se nejprve tkáň prosytit rozpouštědlem parafinu.
1) Fixace - pro zalévání do parafinu se může použít jakákoliv fixační tekutina
2) Odvodnění - tkáň se musí zbavit veškeré vody, aby mohla být prosycena rozpouštědlem parafinu; odvodnění se provádí řadou alkoholů o stoupající koncentraci (viz. otázka č. 2)
3) Prosycování tkáně rozpouštědlem parafinu - jako rozpouštědla parafinu se používají:
a) látky s nižším bodem varu (benzen, xylen, toluen) - jsou to organická rozpouštědla, působí škodlivě na nervovou soustavu; odvodňování v těchto látkách provádíme ve třech lázních po 15 minutách (nemělo by probíhat déle než hodinu, protože potom tkáň tvrdne); protože jsou to látky s vysokým indexem lomu světla, dochází k projasnění tkáně, v místech kde ve tkáni zůstala
voda, nedojde k projasnění, tato místa budou matná, u této tkáně musíme dokončit odvodnění v absolutním alkoholu
b) látky s vyšším bodem varu (metylbenzolát, metylsalycilát) - mají vysokou hustotu, proto do tkáně pronikají pomalu; odvodňování se provádí také ve třech lázních (1. 2 - 4 hod. , 2. 6 - 8 hod , 3. 8 - 12 hod.); po vložení tkáně do tohoto rozpouštědla, vzorek plave, po prosycení klesne na dno, protože je prosycen látkou s vyšší hustotou; tkáň po odvodnění projasní
4) Prosycení tkáně parafinem - aby se parafin dostal do tkáně, musí být v tekutém stavu, proto se prosycování provádí za tepla; bod tání parafinu je obvykle 50 - 60 °C (lepší je použít parafin s nižším bodem varu, aby se tkáň neporušila delším pobytem ve vysoké teplotě); tkáň se prosycuje ve třech lázních parafinu (parafin vytěsňuje rozpouštědlo a proniká do tkáně - lázeň parafinu se tak rozpouštědlem znečisťuje, proto se lázně musí vyměňovat); doba prosycování v jednotlivých lázních: 1. 6 hod, 2. 8 hod., 3. 12 hod.; tkáňové bločky přendaváme z jedné lázně do druhé nahřátou pinzetou, aby na ní netuhl parafin
5) Vlastní zalití do parafinu - přečištěný, tekutý parafin se nalije do zalévací komůrky; do ní vložíme tkáňový bloček prosycený parafinem, řeznou plochou na dno
6) Tmelení parafinových bločků - po ztuhnutí parafinu, se vyjme ze zalévací komůrky a nahřátým nožem se vykrojí tkáňový bloček (kolem tkáně se nechávají asi 0,5 cm okraje); tkáň se přitmelí na dřevěný špalíček, na který se dá nejprve tekutý parafin, přiloží se bloček a nahřátým nožem se objedou hrany bločku; bloček se označí
Zalévání do parafinu, princip a použití metody
Barvení alciánovou modří
- Metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů (např. na průkaz hlenu v pohárkových buňkách...)
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně
Zalévání do parafinu, princip a použití metody
Parafin je měkké médium nerozpustné ve vodě. Je to nejpoužívanější zalévací médium.
PRINCIP: Parafin pronikne do tkáně, vyplní všechny mikroskopické prostory a vytvoří s tkání jednolitou hmotu, která se dá dobře krájet.
POSTUP: Protože je parafin médium nerozpustné ve vodě, musí se nejprve tkáň prosytit rozpouštědlem parafinu.
1) Fixace - pro zalévání do parafinu se může použít jakákoliv fixační tekutina
2) Odvodnění - tkáň se musí zbavit veškeré vody, aby mohla být prosycena rozpouštědlem parafinu; odvodnění se provádí řadou alkoholů o stoupající koncentraci (viz. otázka č. 2)
3) Prosycování tkáně rozpouštědlem parafinu - jako rozpouštědla parafinu se používají:
a) látky s nižším bodem varu (benzen, xylen, toluen) - jsou to organická rozpouštědla, působí škodlivě na nervovou soustavu; odvodňování v těchto látkách provádíme ve třech lázních po 15 minutách (nemělo by probíhat déle než hodinu, protože potom tkáň tvrdne); protože jsou to látky s vysokým indexem lomu světla, dochází k projasnění tkáně, v místech kde ve tkáni zůstala
voda, nedojde k projasnění, tato místa budou matná, u této tkáně musíme dokončit odvodnění v absolutním alkoholu
b) látky s vyšším bodem varu (metylbenzolát, metylsalycilát) - mají vysokou hustotu, proto do tkáně pronikají pomalu; odvodňování se provádí také ve třech lázních (1. 2 - 4 hod. , 2. 6 - 8 hod , 3. 8 - 12 hod.); po vložení tkáně do tohoto rozpouštědla, vzorek plave, po prosycení klesne na dno, protože je prosycen látkou s vyšší hustotou; tkáň po odvodnění projasní
4) Prosycení tkáně parafinem - aby se parafin dostal do tkáně, musí být v tekutém stavu, proto se prosycování provádí za tepla; bod tání parafinu je obvykle 50 - 60 °C (lepší je použít parafin s nižším bodem varu, aby se tkáň neporušila delším pobytem ve vysoké teplotě); tkáň se prosycuje ve třech lázních parafinu (parafin vytěsňuje rozpouštědlo a proniká do tkáně - lázeň parafinu se tak rozpouštědlem znečisťuje, proto se lázně musí vyměňovat); doba prosycování v jednotlivých lázních: 1. 6 hod, 2. 8 hod., 3. 12 hod.; tkáňové bločky přendaváme z jedné lázně do druhé nahřátou pinzetou, aby na ní netuhl parafin
5) Vlastní zalití do parafinu - přečištěný, tekutý parafin se nalije do zalévací komůrky; do ní vložíme tkáňový bloček prosycený parafinem, řeznou plochou na dno
6) Tmelení parafinových bločků - po ztuhnutí parafinu, se vyjme ze zalévací komůrky a nahřátým nožem se vykrojí tkáňový bloček (kolem tkáně se nechávají asi 0,5 cm okraje); tkáň se přitmelí na dřevěný špalíček, na který se dá nejprve tekutý parafin, přiloží se bloček a nahřátým nožem se objedou hrany bločku; bloček se označí
11. PAS reakce – princip, provedení a použití. Zkoušky na přítomnost vody v absolutním alkoholu
11. PAS reakce – princip, provedení a použití.
Zkoušky na přítomnost vody v absolutním alkoholu
PAS reakce – princip, provedení a použití
- metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů a polysacharidů
PRINCIP: Oxidací kyselinou jodistou se z polysacharidů uvolní aldehydické skupiny, které reagují s Schiffovým reagens vznikem růžovo - červeného zbarvení.
Schiffovo reagens – 200ml vařící dest. vody, rozpustí se v ní 1g bazického fuchsinu, ochladit na 50°C, přidat 20ml 1mol HCl, ochladit na 25°C, 2g disiřičitanu sodného nebo draselného, nechat stát 24 hodin v temnu v uzavřené nádobě, přidat 2g aktivního uhlí (slouží k odstranění nečistot) protřepat a zfiltrovat
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) 1% kyselina jodistá 5 minut, praní ve vodě 10 minut
3) Schiffovo reagens 5 – 20 minut v temnu, praní ve vodě 10 minut
4) Harrisův hematoxylin 3 – 5 minut, oplach vodou 5 minut
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
PAS+ substance (glykogen, neutrální mukopolysacharidy, mukoproteiny) – purpurově červeně
Jádra – modře
PAS reakce s kontrolním řezem (glykogen)
Slouží k odlišení glykogenu od jiných PAS+ látek
Kontrolní řez – před provedením PAS reakce působíme enzymy diastázou nebo ptichinem (ve slinách), které štěpí glykogen (glukóza); po provedení reakce oba řezy porovnáváme
A) kontrolní řez PAS reakce- = glykogen
B) reakce + v obou řezech = PAS+ diastázorezistentní polysacharid
1) Deparafinace, rozdělit na dvě skupiny – jeden kontrolní (jde o řezy stejné tkáně)
2) Kontrolní řez inkubovat při pokojové teplotě v 1% roztoku diastázy – 30 minut; místo diastázy lze použít slin, vyprat v dest. vodě
3) Všechny řezy PAS reakce s dobarvením Harrisovým hematoxylinem
4) Odvodnění, projasnění, montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Zrna glykogenu – purpurově červeně
Jádra – modře
Kontrolní řez – zrna chybějí
Zkoušky na přítomnost vody v absolutním alkoholu
Absolutní alkohol získaný pomocí vyžíhané modré skalice není vždy úplně bezvodý, ale má koncentraci asi 99 %, to pro běžné histologické metody stačí.
O množství vody v absolutním alkoholu se můžeme přesvědčit zkouškou s benzenem nebo karbidem vápníku.
- Zkouška s benzenem
Do zkumavky s benzenem kápneme několik kapek absolutního alkoholu, pokud obsahuje vodu, vznikne bělavé zakalení
- Zkouška s karbidem vápníku
Do zkumavky se zkoumaným alkoholem se dá kousek karbidu vápníku, pokud obsahuje i malé množství vody, uvolní se acetylen a vznikne bělavé zakalení.
Zkoušky na přítomnost vody v absolutním alkoholu
PAS reakce – princip, provedení a použití
- metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů a polysacharidů
PRINCIP: Oxidací kyselinou jodistou se z polysacharidů uvolní aldehydické skupiny, které reagují s Schiffovým reagens vznikem růžovo - červeného zbarvení.
Schiffovo reagens – 200ml vařící dest. vody, rozpustí se v ní 1g bazického fuchsinu, ochladit na 50°C, přidat 20ml 1mol HCl, ochladit na 25°C, 2g disiřičitanu sodného nebo draselného, nechat stát 24 hodin v temnu v uzavřené nádobě, přidat 2g aktivního uhlí (slouží k odstranění nečistot) protřepat a zfiltrovat
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) 1% kyselina jodistá 5 minut, praní ve vodě 10 minut
3) Schiffovo reagens 5 – 20 minut v temnu, praní ve vodě 10 minut
4) Harrisův hematoxylin 3 – 5 minut, oplach vodou 5 minut
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
PAS+ substance (glykogen, neutrální mukopolysacharidy, mukoproteiny) – purpurově červeně
Jádra – modře
PAS reakce s kontrolním řezem (glykogen)
Slouží k odlišení glykogenu od jiných PAS+ látek
Kontrolní řez – před provedením PAS reakce působíme enzymy diastázou nebo ptichinem (ve slinách), které štěpí glykogen (glukóza); po provedení reakce oba řezy porovnáváme
A) kontrolní řez PAS reakce- = glykogen
B) reakce + v obou řezech = PAS+ diastázorezistentní polysacharid
1) Deparafinace, rozdělit na dvě skupiny – jeden kontrolní (jde o řezy stejné tkáně)
2) Kontrolní řez inkubovat při pokojové teplotě v 1% roztoku diastázy – 30 minut; místo diastázy lze použít slin, vyprat v dest. vodě
3) Všechny řezy PAS reakce s dobarvením Harrisovým hematoxylinem
4) Odvodnění, projasnění, montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Zrna glykogenu – purpurově červeně
Jádra – modře
Kontrolní řez – zrna chybějí
Zkoušky na přítomnost vody v absolutním alkoholu
Absolutní alkohol získaný pomocí vyžíhané modré skalice není vždy úplně bezvodý, ale má koncentraci asi 99 %, to pro běžné histologické metody stačí.
O množství vody v absolutním alkoholu se můžeme přesvědčit zkouškou s benzenem nebo karbidem vápníku.
- Zkouška s benzenem
Do zkumavky s benzenem kápneme několik kapek absolutního alkoholu, pokud obsahuje vodu, vznikne bělavé zakalení
- Zkouška s karbidem vápníku
Do zkumavky se zkoumaným alkoholem se dá kousek karbidu vápníku, pokud obsahuje i malé množství vody, uvolní se acetylen a vznikne bělavé zakalení.
10. Průkaz žíhaného lemu resorpčního epitelu. Příprava a použití Bouinovy tekutiny
10. Průkaz žíhaného lemu resorpčního epitelu.
Příprava a použití Bouinovy tekutiny
Průkaz žíhaného lemu resorpčního epitelu
- Resorpční epitel obsahuje alkalickou fosfatázu, proto se dá prokázat metodou na průkaz alkalické fosfatázy
Alkalická fosfatáza
PRINCIP: Působením enzymu se ze substrátu (sloučeniny naftolu) odštěpí naftol, který reaguje s diazoniovou solí (stabilizovaným diazotátem) vznikem barevné, ve vodě nerozpustné sraženiny - azobarviva. Výhodou této reakce je, že se naftoly v těle nevyskytují, proto je reakce specifická.
1) Deparafinace X1, X2, aceton1, aceton2 3 – 5 minut, oplach řezů v dest. vodě
2) Inkubace 20 – 30 minut při 37°C Inkubační roztok: veronalacetátový pufr pH 9,1 …1 díl 20ml substrát - alfa - naftil fosfát diazotovaná sůl FAST RED TR alfa smísit, přefiltrovat
3) Oplach v dest. vodě, hematoxylin 2 minuty, dobarvení jader pramenitou vodou
4) Montování do medií rozpustných ve vodě; pokud chceme řezy uchovat delší dobu je vhodná glycerinová želatina – tuhne při pokojové teplotě
VÝSLEDEK BARVENÍ
Hnědočervené azobarvivo vznikne v místě výskytu alkalické fosfatázy
- Nachází se zde také glykoproteiny- glykokalix, proto slouží k jeho průkazu také PAS – reakce
PAS reakce
- metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů a polysacharidů
PRINCIP: Oxidací kyselinou jodistou se z polysacharidů uvolní aldehydické skupiny, které reagují s Schiffovým reagens vznikem růžovo - červeného zbarvení.
Schiffovo reagens – 200ml vařící dest. vody, rozpustí se v ní 1g bazického fuchsinu, ochladit na 50°C, přidat 20ml 1mol HCl, ochladit na 25°C, 2g disiřičitanu sodného nebo draselného, nechat stát 24 hodin v temnu v uzavřené nádobě, přidat 2g aktivního uhlí (slouží k odstranění nečistot) protřepat a zfiltrovat
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) 1% kyselina jodistá 5 minut, praní ve vodě 10 minut
3) Schiffovo reagens 5 – 20 minut v temnu, praní ve vodě 10 minut
4) Harrisův hematoxylin 3 – 5 minut, oplach vodou 5 minut
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
PAS+ substance (glykogen, neutrální mukopolysacharidy, mukoproteiny) – purpurově červeně
Jádra – modře
Alciánová modř
- Metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů (např. na průkaz hlenu v pohárkových buňkách...)
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně
Příprava a použití Bouinovy tekutiny
Patří do skupiny fixačních tekutin s kyselinou pikrovou. Obsahuje 1 díl formolu + 3 díly vodného nasyceného roztoku kyseliny pikrové, na 100 ml zásobního roztoku se přidává 5 ml ledové kyseliny octové. Tekutina má žlutou barvu a tuto barvu získává i tkáň, která je v ní fixována. Doba fixace je přibližně 24 hodin.
Nepoužívá se pro fixaci tkání, které obsahují velké množství krve, protože krev hemolyzuje, tvoří hrudky a tkáň se špatně krájí. Také se nepoužívá pro fixaci tkání, které chceme zalévat do celoidinu, protože kyselina pikrová zabraňuje pronikání celoidinu do tkáně.
Po fixaci se tkáň vkládá do 80 % alkoholu. Nepropírá se ve vodě, protože by došlo k bobtnání vaziva a tkáň by se špatně krájela.
Příprava a použití Bouinovy tekutiny
Průkaz žíhaného lemu resorpčního epitelu
- Resorpční epitel obsahuje alkalickou fosfatázu, proto se dá prokázat metodou na průkaz alkalické fosfatázy
Alkalická fosfatáza
PRINCIP: Působením enzymu se ze substrátu (sloučeniny naftolu) odštěpí naftol, který reaguje s diazoniovou solí (stabilizovaným diazotátem) vznikem barevné, ve vodě nerozpustné sraženiny - azobarviva. Výhodou této reakce je, že se naftoly v těle nevyskytují, proto je reakce specifická.
1) Deparafinace X1, X2, aceton1, aceton2 3 – 5 minut, oplach řezů v dest. vodě
2) Inkubace 20 – 30 minut při 37°C Inkubační roztok: veronalacetátový pufr pH 9,1 …1 díl 20ml substrát - alfa - naftil fosfát diazotovaná sůl FAST RED TR alfa smísit, přefiltrovat
3) Oplach v dest. vodě, hematoxylin 2 minuty, dobarvení jader pramenitou vodou
4) Montování do medií rozpustných ve vodě; pokud chceme řezy uchovat delší dobu je vhodná glycerinová želatina – tuhne při pokojové teplotě
VÝSLEDEK BARVENÍ
Hnědočervené azobarvivo vznikne v místě výskytu alkalické fosfatázy
- Nachází se zde také glykoproteiny- glykokalix, proto slouží k jeho průkazu také PAS – reakce
PAS reakce
- metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů a polysacharidů
PRINCIP: Oxidací kyselinou jodistou se z polysacharidů uvolní aldehydické skupiny, které reagují s Schiffovým reagens vznikem růžovo - červeného zbarvení.
Schiffovo reagens – 200ml vařící dest. vody, rozpustí se v ní 1g bazického fuchsinu, ochladit na 50°C, přidat 20ml 1mol HCl, ochladit na 25°C, 2g disiřičitanu sodného nebo draselného, nechat stát 24 hodin v temnu v uzavřené nádobě, přidat 2g aktivního uhlí (slouží k odstranění nečistot) protřepat a zfiltrovat
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) 1% kyselina jodistá 5 minut, praní ve vodě 10 minut
3) Schiffovo reagens 5 – 20 minut v temnu, praní ve vodě 10 minut
4) Harrisův hematoxylin 3 – 5 minut, oplach vodou 5 minut
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
PAS+ substance (glykogen, neutrální mukopolysacharidy, mukoproteiny) – purpurově červeně
Jádra – modře
Alciánová modř
- Metoda na průkaz kyselých mukopolysacharidů (např. na průkaz hlenu v pohárkových buňkách...)
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně
Příprava a použití Bouinovy tekutiny
Patří do skupiny fixačních tekutin s kyselinou pikrovou. Obsahuje 1 díl formolu + 3 díly vodného nasyceného roztoku kyseliny pikrové, na 100 ml zásobního roztoku se přidává 5 ml ledové kyseliny octové. Tekutina má žlutou barvu a tuto barvu získává i tkáň, která je v ní fixována. Doba fixace je přibližně 24 hodin.
Nepoužívá se pro fixaci tkání, které obsahují velké množství krve, protože krev hemolyzuje, tvoří hrudky a tkáň se špatně krájí. Také se nepoužívá pro fixaci tkání, které chceme zalévat do celoidinu, protože kyselina pikrová zabraňuje pronikání celoidinu do tkáně.
Po fixaci se tkáň vkládá do 80 % alkoholu. Nepropírá se ve vodě, protože by došlo k bobtnání vaziva a tkáň by se špatně krájela.
9. Průkaz alkalické fosfatázy. Bakerova tekutina, příprava a její použití
9. Průkaz alkalické fosfatázy.
Bakerova tekutina, příprava a její použití
Průkaz alkalické fosfatázy
- k průkazu alkalické fosfatázy slouží azokopulační reakce
substrát – látka, se kterou enzym reaguje; sloučenina s naftalenem
enzym naftol
fosfát nebo acetát – vyskytuje se běžně v organismu, nemá smysl ho prokazovat
naftol + diazotovaná sůl -> azobarvivo (nerozpustné ve vodě)
PRINCIP: Působením enzymu se ze substrátu (sloučeniny naftolu) odštěpí naftol, který reaguje s diazoniovou solí (stabilizovaným diazotátem) vznikem barevné, ve vodě nerozpustné sraženiny - azobarviva. Výhodou této reakce je, že se naftoly v těle nevyskytují, proto je reakce specifická.
1) Deparafinace X1, X2, aceton1, aceton2 3 – 5 minut, oplach řezů v dest. vodě
2) Inkubace 20 – 30 minut při 37°C Inkubační roztok: veronalacetátový pufr pH 9,1 …1 díl 20ml substrát - alfa - naftil fosfát diazotovaná sůl FAST RED TR alfa smísit, přefiltrovat
3) Oplach v dest. vodě, hematoxylin 2 minuty, dobarvení jader pramenitou vodou
4) Montování do medií rozpustných ve vodě; pokud chceme řezy uchovat delší dobu je vhodná glycerinová želatina – tuhne při pokojové teplotě
VÝSLEDEK BARVENÍ
Hnědočervené azobarvivo vznikne v místě výskytu alkalické fosfatázy
VÝSKYT alkalické fosfatázy – žíhaný lem resorpčního epitelu (sliznice tenkého střeva, proximální tubulus ledvin)
Bakerova tekutina, příprava a její výskyt
Bakerova tekutina patří mezi formolové fixační tekutiny, je to 10 % formol obohacený o chlorid vápenatý. Používá se k fixaci tkání, ve kterých mají být prokazovány lipidy nebo enzymy.
Bakerova tekutina, příprava a její použití
Průkaz alkalické fosfatázy
- k průkazu alkalické fosfatázy slouží azokopulační reakce
substrát – látka, se kterou enzym reaguje; sloučenina s naftalenem
enzym naftol
fosfát nebo acetát – vyskytuje se běžně v organismu, nemá smysl ho prokazovat
naftol + diazotovaná sůl -> azobarvivo (nerozpustné ve vodě)
PRINCIP: Působením enzymu se ze substrátu (sloučeniny naftolu) odštěpí naftol, který reaguje s diazoniovou solí (stabilizovaným diazotátem) vznikem barevné, ve vodě nerozpustné sraženiny - azobarviva. Výhodou této reakce je, že se naftoly v těle nevyskytují, proto je reakce specifická.
1) Deparafinace X1, X2, aceton1, aceton2 3 – 5 minut, oplach řezů v dest. vodě
2) Inkubace 20 – 30 minut při 37°C Inkubační roztok: veronalacetátový pufr pH 9,1 …1 díl 20ml substrát - alfa - naftil fosfát diazotovaná sůl FAST RED TR alfa smísit, přefiltrovat
3) Oplach v dest. vodě, hematoxylin 2 minuty, dobarvení jader pramenitou vodou
4) Montování do medií rozpustných ve vodě; pokud chceme řezy uchovat delší dobu je vhodná glycerinová želatina – tuhne při pokojové teplotě
VÝSLEDEK BARVENÍ
Hnědočervené azobarvivo vznikne v místě výskytu alkalické fosfatázy
VÝSKYT alkalické fosfatázy – žíhaný lem resorpčního epitelu (sliznice tenkého střeva, proximální tubulus ledvin)
Bakerova tekutina, příprava a její výskyt
Bakerova tekutina patří mezi formolové fixační tekutiny, je to 10 % formol obohacený o chlorid vápenatý. Používá se k fixaci tkání, ve kterých mají být prokazovány lipidy nebo enzymy.
8. Průkaz nespecifické esterázy. Zpracování materiálu pro průkaz enzymů
8. Průkaz nespecifické esterázy.
Zpracování materiálu pro průkaz enzymů
Průkaz nespecifické esterázy
- provádí se azokopulační reakcí
PRINCIP: Působením enzymu se ze substrátu (sloučeniny naftolu) odštěpí naftol, který reaguje s diazoniovou solí (stabilizovaným diazotátem) vznikem barevné, ve vodě nerozpustné sraženiny - azobarviva. Výhodou této reakce je, že se naftoly v těle nevyskytují, proto je reakce specifická.
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Inkubace při pokojové teplotě 10 – 20 minut; případně zvýšíme teplotu na 37°C Inkubační roztok: 0,2M fosfátový pufr pH 7,4 20ml alfa - nafthylacetát – substrát alfa do suché nádobky nejprve alfa - nafthylacetát, který rozpustíme v několika kapkách acetonu, potom pufr + diazovanou sůl (Fast Blue BB) alfa přefiltrovat
3) Oplach v dest. vodě, jádrová červeň 5 – 15 minut alfa dobarvení jader, oplach v dest. vodě
4) Montování do medií rozpustných ve vodě (např. glycerin)
VÝSLEDEK BARVENÍ
Černé azobarvivo v místě výskytu nespecifické esterázy
Jádra – červeně
VÝSKYT nespecifické esterázy – v cytoplazmě, v mitochondriích
Zpracování materiálu pro průkaz enzymů
Tkáň pro vyšetření enzymů má být zpracována co nejrychleji po odběru. Zpracovává se buď nefixovaná tkáň, protože se některé enzymy fixací inaktivují, nebo se zpracovává tkáň fixovaná.
- Zpracování nefixované tkáně
tkáň krájíme na zmrazovacím mikrotomu - kryostatu
- Zpracování fixované tkáně
k fixaci se používá vychlazený aceton nebo formol, fixujeme při 0 - 4 °C v ledničce; tkáň fixovanou acetonem zaléváme zkráceným způsobem do parafinu (prosycování tkáně rozpouštědlem parafinu i samotným parafinem zkracujeme na minimum); vychlazeným formolem (neutrálním formolem, Bakerovou tekutinou ...) fixujeme v ledničce při 0 - 4 °C; tkáň fixovanou formolem krájíme na zmrazovacím mikrotomu nebo ji zkráceným způsobem zaléváme do parafinu; při odvodňování však nahrazujeme alkohol acetonem; doba fixace se pohybuje od 2 do 12 hodin
Při zpracování tkáně dochází vždy k částečnému poklesu enzymové aktivity
Zpracování materiálu pro průkaz enzymů
Průkaz nespecifické esterázy
- provádí se azokopulační reakcí
PRINCIP: Působením enzymu se ze substrátu (sloučeniny naftolu) odštěpí naftol, který reaguje s diazoniovou solí (stabilizovaným diazotátem) vznikem barevné, ve vodě nerozpustné sraženiny - azobarviva. Výhodou této reakce je, že se naftoly v těle nevyskytují, proto je reakce specifická.
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Inkubace při pokojové teplotě 10 – 20 minut; případně zvýšíme teplotu na 37°C Inkubační roztok: 0,2M fosfátový pufr pH 7,4 20ml alfa - nafthylacetát – substrát alfa do suché nádobky nejprve alfa - nafthylacetát, který rozpustíme v několika kapkách acetonu, potom pufr + diazovanou sůl (Fast Blue BB) alfa přefiltrovat
3) Oplach v dest. vodě, jádrová červeň 5 – 15 minut alfa dobarvení jader, oplach v dest. vodě
4) Montování do medií rozpustných ve vodě (např. glycerin)
VÝSLEDEK BARVENÍ
Černé azobarvivo v místě výskytu nespecifické esterázy
Jádra – červeně
VÝSKYT nespecifické esterázy – v cytoplazmě, v mitochondriích
Zpracování materiálu pro průkaz enzymů
Tkáň pro vyšetření enzymů má být zpracována co nejrychleji po odběru. Zpracovává se buď nefixovaná tkáň, protože se některé enzymy fixací inaktivují, nebo se zpracovává tkáň fixovaná.
- Zpracování nefixované tkáně
tkáň krájíme na zmrazovacím mikrotomu - kryostatu
- Zpracování fixované tkáně
k fixaci se používá vychlazený aceton nebo formol, fixujeme při 0 - 4 °C v ledničce; tkáň fixovanou acetonem zaléváme zkráceným způsobem do parafinu (prosycování tkáně rozpouštědlem parafinu i samotným parafinem zkracujeme na minimum); vychlazeným formolem (neutrálním formolem, Bakerovou tekutinou ...) fixujeme v ledničce při 0 - 4 °C; tkáň fixovanou formolem krájíme na zmrazovacím mikrotomu nebo ji zkráceným způsobem zaléváme do parafinu; při odvodňování však nahrazujeme alkohol acetonem; doba fixace se pohybuje od 2 do 12 hodin
Při zpracování tkáně dochází vždy k částečnému poklesu enzymové aktivity
7. Barvení orceinem. Zpracování tvrdých tkání pro histologické vyšetření
7. Barvení orceinem.
Zpracování tvrdých tkání pro histologické vyšetření
Barvení orceinem
- barvící metoda na průkaz elastických vláken
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Orcein – 30 – 60 minut při 38°C, oplach v dest. vodě
3) Diferenciace kyselým alkoholem, oplach v dest. vodě
4) Mayerův nebo Harrisův hematoxylin – 5-8 minut, oplach v pramenité vodě (-> modrání jader)
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Elastická vlákna – sytě červenohnědě
Jádra – modře
Zpracování tvrdých tkání pro histologické vyšetření
Tvrdé tkáně, jako je zub, kost, zvápenatělá chrupavka, zvápenatělé vazivo, obsahují velké množství minerálních solí. Před zhotovením preparátu se musí tkáně těchto solí zbavit - demineralizace - dekalcifikace (odvápňování)
- Odvápňování
Spočívá v rozpuštění minerálních solí účinkem zředěných kyselin, které přemění nerozpustné soli. Tkáň musí být dobře fixována; po fixaci důkladně vyprána v alkoholu popř. ve vodě (podle druhu fixační tekutiny; odvápnění musí být rychlé; po skončení odvápňování musíme odstranit dekalcifikační tekutiny vypráním v roztoku nějaké soli – 5% kamenec draselný, 5ˇsíran sodný nebo lithný; odvápněnou tkáň nepřenášíme z dekalcifikační tekutiny do vody neboť by došlo ke zbobtnání vazivA. Doba odvápnění závisí na velikosti bločku a na druhu dekalcifikační tekutiny, správný stupeň odvápnění poznáme nejlépe naříznutím tkáně. Stupeň odvápnění lze určit i chemicky: k 5ml dekalcifikační tekutiny slité z odvápněné tkáně dáme 5ml hydroxidu amonného, 5 ml šťavelanu amonného, promícháme, necháme stát 15 – 30 sekund, roztok se mléčně kalí, tkáň není odvápněná. Odvápněnou tkáň můžeme krájet na zmrazovacím mikrotomu, nebo je zaléváme do celoidinu nebo celodalu, lze zalít i do parafínu, ale obtížně se krájí.
- Dekalcifikační tekutiny
- 5% kyselina dusičná – potom tkáň vypíráme 24hodin v 5% síranu sodném nebo litném a pak 24hodin v tekoucí vodě
- 5% kyselina trichloroctová – potom pereme v 96%, 90% alkoholu
- kyselina mravenčí, odvápnění šetrné, zůstává barvitelnost tkání
- EDTA (kyselina etylendiaminotetraoctová)
Zpracování tvrdých tkání pro histologické vyšetření
Barvení orceinem
- barvící metoda na průkaz elastických vláken
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Orcein – 30 – 60 minut při 38°C, oplach v dest. vodě
3) Diferenciace kyselým alkoholem, oplach v dest. vodě
4) Mayerův nebo Harrisův hematoxylin – 5-8 minut, oplach v pramenité vodě (-> modrání jader)
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Elastická vlákna – sytě červenohnědě
Jádra – modře
Zpracování tvrdých tkání pro histologické vyšetření
Tvrdé tkáně, jako je zub, kost, zvápenatělá chrupavka, zvápenatělé vazivo, obsahují velké množství minerálních solí. Před zhotovením preparátu se musí tkáně těchto solí zbavit - demineralizace - dekalcifikace (odvápňování)
- Odvápňování
Spočívá v rozpuštění minerálních solí účinkem zředěných kyselin, které přemění nerozpustné soli. Tkáň musí být dobře fixována; po fixaci důkladně vyprána v alkoholu popř. ve vodě (podle druhu fixační tekutiny; odvápnění musí být rychlé; po skončení odvápňování musíme odstranit dekalcifikační tekutiny vypráním v roztoku nějaké soli – 5% kamenec draselný, 5ˇsíran sodný nebo lithný; odvápněnou tkáň nepřenášíme z dekalcifikační tekutiny do vody neboť by došlo ke zbobtnání vazivA. Doba odvápnění závisí na velikosti bločku a na druhu dekalcifikační tekutiny, správný stupeň odvápnění poznáme nejlépe naříznutím tkáně. Stupeň odvápnění lze určit i chemicky: k 5ml dekalcifikační tekutiny slité z odvápněné tkáně dáme 5ml hydroxidu amonného, 5 ml šťavelanu amonného, promícháme, necháme stát 15 – 30 sekund, roztok se mléčně kalí, tkáň není odvápněná. Odvápněnou tkáň můžeme krájet na zmrazovacím mikrotomu, nebo je zaléváme do celoidinu nebo celodalu, lze zalít i do parafínu, ale obtížně se krájí.
- Dekalcifikační tekutiny
- 5% kyselina dusičná – potom tkáň vypíráme 24hodin v 5% síranu sodném nebo litném a pak 24hodin v tekoucí vodě
- 5% kyselina trichloroctová – potom pereme v 96%, 90% alkoholu
- kyselina mravenčí, odvápnění šetrné, zůstává barvitelnost tkání
- EDTA (kyselina etylendiaminotetraoctová)
6. Heidenhainovo barvení. Odběr materiálu pro histologické vyšetření
6. Heidenhainovo barvení.
Odběr materiálu pro histologické vyšetření
Heidenhainovo barvení
- základní cytologická metoda, slouží k zvýraznění některých cytologických struktur např. mitochondrie, centrioly, chromatin
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve dest. vodě – 5 minut
2) Moření v 2,5% kamenci železitém (síran železito amonný) - 24 hodin (20 minut ve škole), oplach dest. vodě
3) Alkoholický roztok hematoxylinu – 24 hodin (20 minut ve škole), oplach v dest. vodě
4) Diferenciace ve 2,5% kamenci železitém (zčernání jader a plazma šedá)
5) Praní v pramenité vodě – 15 minut
6) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jaderný chromatin, mitochondrie, sekreční granula – modročerně až hnědočerně
Odběr materiálu pro histologické vyšetření
- BIOPSIE – materiál získaný při operacích; odběr z živého organismu
- EXCIZE – vyříznutí malého kousku tkáně (při vyšetřování kůže; provádí se skalpelem nebo žiletkou) provádí se při podezření na nádorové bujení
- KYRETÁŽ – seškrábnou se malé částečky tkáně kyretou (malá lžička s ostrými okraji); vyšetření děložní sliznice nebo se zavádí do dutých orgánů
Bronchoskop – bronchoskopie
Gastroskop – gastroskopie (částečky žaludeční sliznice)
- PUNKCE – napíchnutí orgánu jehlou nasazenou na injekci do níž se nasají tahem pístu malé částečky tkáně (slezina, ledviny, játra), tkáň musí být ihned fixována a označena
- NEKROPSIE – materiál získaný při pitvě; odběr z mrtvého organismu
o provádí se pouze excize
Odběr materiálu pro histologické vyšetření
Heidenhainovo barvení
- základní cytologická metoda, slouží k zvýraznění některých cytologických struktur např. mitochondrie, centrioly, chromatin
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve dest. vodě – 5 minut
2) Moření v 2,5% kamenci železitém (síran železito amonný) - 24 hodin (20 minut ve škole), oplach dest. vodě
3) Alkoholický roztok hematoxylinu – 24 hodin (20 minut ve škole), oplach v dest. vodě
4) Diferenciace ve 2,5% kamenci železitém (zčernání jader a plazma šedá)
5) Praní v pramenité vodě – 15 minut
6) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jaderný chromatin, mitochondrie, sekreční granula – modročerně až hnědočerně
Odběr materiálu pro histologické vyšetření
- BIOPSIE – materiál získaný při operacích; odběr z živého organismu
- EXCIZE – vyříznutí malého kousku tkáně (při vyšetřování kůže; provádí se skalpelem nebo žiletkou) provádí se při podezření na nádorové bujení
- KYRETÁŽ – seškrábnou se malé částečky tkáně kyretou (malá lžička s ostrými okraji); vyšetření děložní sliznice nebo se zavádí do dutých orgánů
Bronchoskop – bronchoskopie
Gastroskop – gastroskopie (částečky žaludeční sliznice)
- PUNKCE – napíchnutí orgánu jehlou nasazenou na injekci do níž se nasají tahem pístu malé částečky tkáně (slezina, ledviny, játra), tkáň musí být ihned fixována a označena
- NEKROPSIE – materiál získaný při pitvě; odběr z mrtvého organismu
o provádí se pouze excize
5. Barvení azanem. Zkvalitňování parafinu
5. Barvení azanem.
Zkvalitňování parafinu
Barvení azanem
- přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Azokarmín při 58°C – 30 minut
3) Krátký oplach v dest. vodě, diferencování v anilinovém alkoholu (96% alkohol + anilinový olej), přerušení diferenciace opláchnutím v kyselém alkoholu okyseleném kyselinou octovou, oplach v dest, vodě
4) Moření 5% kyselinou fosfowolframovou – 5 –10 minut, oplach v dest. vodě
5) Anilinová modř + orange G – 5minut, oplach v dest. vodě
6) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – karmínově červeně
Erytrocyty – oranžově červeně
Kolagenní vazivo – jasně modře
Svalstvo – červeně
Hlen a amyloid – modře
Zkvalitňování parafinu
Surový parafin, který přichází do laboratoře, obsahuje různé nečistoty, proto se musí přepalovat.
Přepalování se provádí na elektrické ploténce, několik hodin, až do zhnědnutí parafinu. Protože při přepalování unikají z parafinu také některé karcinogenní látky, musí se provádět v digestoři.
Do teplého přepáleného parafinu se přidá 3 - 5 % včelího vosku, musí se dát přesné množství, pokud ho dáme málo, bude parafin drobivý, pokud moc, bude naopak mazlavý. Takto připravený parafin se v termostatu přefiltruje a může se použít k zalévání.
Někdy se přepalování provádí v termostatu při teplotě 70 °C ( 2 - 3 dny )
- nevýhodou je, že se v termostatu hromadí škodlivé plyny.
- proprání ve vodě
Zkvalitňování parafinu
Barvení azanem
- přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Azokarmín při 58°C – 30 minut
3) Krátký oplach v dest. vodě, diferencování v anilinovém alkoholu (96% alkohol + anilinový olej), přerušení diferenciace opláchnutím v kyselém alkoholu okyseleném kyselinou octovou, oplach v dest, vodě
4) Moření 5% kyselinou fosfowolframovou – 5 –10 minut, oplach v dest. vodě
5) Anilinová modř + orange G – 5minut, oplach v dest. vodě
6) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – karmínově červeně
Erytrocyty – oranžově červeně
Kolagenní vazivo – jasně modře
Svalstvo – červeně
Hlen a amyloid – modře
Zkvalitňování parafinu
Surový parafin, který přichází do laboratoře, obsahuje různé nečistoty, proto se musí přepalovat.
Přepalování se provádí na elektrické ploténce, několik hodin, až do zhnědnutí parafinu. Protože při přepalování unikají z parafinu také některé karcinogenní látky, musí se provádět v digestoři.
Do teplého přepáleného parafinu se přidá 3 - 5 % včelího vosku, musí se dát přesné množství, pokud ho dáme málo, bude parafin drobivý, pokud moc, bude naopak mazlavý. Takto připravený parafin se v termostatu přefiltruje a může se použít k zalévání.
Někdy se přepalování provádí v termostatu při teplotě 70 °C ( 2 - 3 dny )
- nevýhodou je, že se v termostatu hromadí škodlivé plyny.
- proprání ve vodě
4. Barvení modrým trichromem. Zalévání do celoidinu, postup a použití
4. Barvení modrým trichromem.
Zalévání do celoidinu, postup a použití
Barvením modrým trichromem
- přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu anilinová modř – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – modře
Svalstvo – červeně
Zalévání do celoidinu, postup a použití
Celoidin je tvrdé zalévací médium nerozpustné ve vodě.
- je to nitrát celulózy, suchý celoidin má vatovou strukturu - proceloidin, před použitím se musí rozpustit alkoholetherem na 10 % koncentraci
- proceloidin je výbušnina, nesmí se pracovat s otevřeným ohněm
POSTUP:
1) Fixace
- používá se jakákoliv fixační tekutina, kromě Buenovy tekutiny, protože kyselina pikrová v ní obsažená, brání pronikání celoidinu do tkáně
2) Odvodňování tkáňového bločku
- řadou alkoholů se stoupající koncentrací
70% - 2 hodiny
80% - 4-6 hodin
96% - 6 hodin
100% - 3x 2 hodiny
3) Prosycování rozpouštědlem celoidinu
- rozpouštědlem celoidinu je alkoholether ( směs absolutního alkoholu a etheru v poměru 1 : 1 )
- provádí se v dobře uzavřené nádobě, při pokojové teplotě 8 - 12 hodin
4) Prosycování tkáně celoidinem
- tkáň se prosycuje třemi koncentracemi celoidinu ( 2,5 % , 5 % a 10 % )
- provádí se v dobře uzavřené nádobce, aby neunikal ether, tím by se zvyšovala koncentrace a mohl by vzniknout až suchý celoidin
a) prosycování 2,5 % celoidinem - 24 hodin - 3 dny
b) prosycování 5 % celoidinem - 3 - 7 dní
c) prosycování 10 % celoidinem - 1 - 4 týdny
5) Vlastní zalití do celoidinu
- do skleněné nádobky s plochým dnem nalijeme 10 % celoidin
- celoidinu musí být dostatečné množství protože při tuhnutí se jeho objem snižuje až o polovinu
- bloček zalitý do celoidinu přeneseme do nádobky - řeznou plochou na dno
- nejprve nádobku na několik hodin uzavřeme, aby mohli unikat bublinky
- poté ji mírně pootevřeme a necháme pomalu unikat ether, aby celoidin tuhl rovnoměrně
- zalévání se provádí v exsikátoru, kde je hygroskopická látka, aby se celoidin nemísil s vodou
- po ztuhnutí celoidinu se vykrojí celoidinový bloček, který se ukládá v 70 % alkoholu, aby nevysychal
6) Krájení
- krájí se na sáňkovém mikrotomu, šikmo nastaveným nožem
- při krájení se potírá v 70 % alkoholem, ve kterém se ukládají také řezy
Použití
- běžně se nepoužívá, protože doba zalévání je příliš dlouhá
- používá se pro zalévání tvrdých tkání (zub, kost, zvápenatělá chrupavka, šlacha), tyto tkáně by se špatně krájely v parafinu.
Zalévání do celoidinu, postup a použití
Barvením modrým trichromem
- přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu anilinová modř – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – modře
Svalstvo – červeně
Zalévání do celoidinu, postup a použití
Celoidin je tvrdé zalévací médium nerozpustné ve vodě.
- je to nitrát celulózy, suchý celoidin má vatovou strukturu - proceloidin, před použitím se musí rozpustit alkoholetherem na 10 % koncentraci
- proceloidin je výbušnina, nesmí se pracovat s otevřeným ohněm
POSTUP:
1) Fixace
- používá se jakákoliv fixační tekutina, kromě Buenovy tekutiny, protože kyselina pikrová v ní obsažená, brání pronikání celoidinu do tkáně
2) Odvodňování tkáňového bločku
- řadou alkoholů se stoupající koncentrací
70% - 2 hodiny
80% - 4-6 hodin
96% - 6 hodin
100% - 3x 2 hodiny
3) Prosycování rozpouštědlem celoidinu
- rozpouštědlem celoidinu je alkoholether ( směs absolutního alkoholu a etheru v poměru 1 : 1 )
- provádí se v dobře uzavřené nádobě, při pokojové teplotě 8 - 12 hodin
4) Prosycování tkáně celoidinem
- tkáň se prosycuje třemi koncentracemi celoidinu ( 2,5 % , 5 % a 10 % )
- provádí se v dobře uzavřené nádobce, aby neunikal ether, tím by se zvyšovala koncentrace a mohl by vzniknout až suchý celoidin
a) prosycování 2,5 % celoidinem - 24 hodin - 3 dny
b) prosycování 5 % celoidinem - 3 - 7 dní
c) prosycování 10 % celoidinem - 1 - 4 týdny
5) Vlastní zalití do celoidinu
- do skleněné nádobky s plochým dnem nalijeme 10 % celoidin
- celoidinu musí být dostatečné množství protože při tuhnutí se jeho objem snižuje až o polovinu
- bloček zalitý do celoidinu přeneseme do nádobky - řeznou plochou na dno
- nejprve nádobku na několik hodin uzavřeme, aby mohli unikat bublinky
- poté ji mírně pootevřeme a necháme pomalu unikat ether, aby celoidin tuhl rovnoměrně
- zalévání se provádí v exsikátoru, kde je hygroskopická látka, aby se celoidin nemísil s vodou
- po ztuhnutí celoidinu se vykrojí celoidinový bloček, který se ukládá v 70 % alkoholu, aby nevysychal
6) Krájení
- krájí se na sáňkovém mikrotomu, šikmo nastaveným nožem
- při krájení se potírá v 70 % alkoholem, ve kterém se ukládají také řezy
Použití
- běžně se nepoužívá, protože doba zalévání je příliš dlouhá
- používá se pro zalévání tvrdých tkání (zub, kost, zvápenatělá chrupavka, šlacha), tyto tkáně by se špatně krájely v parafinu.
3. Barvením zeleným trichromem. Zalévání do želatiny, princip a použití
3. Barvením zeleným trichromem.
Zalévání do želatiny, princip a použití
Barvení zeleným trichromem
- přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu světlá zeleň – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – zeleně
Svalstvo – červeně
Zalévání do želatiny, princip a použití
- želatina je měkké zalévací médium rozpustné ve vodě
- používá se pro zalévání řídkých tkání, které chceme zpevnit, nebo pokud tkáň chceme uchovat delší dobu
- želatina vytěsní z tkáně vodu, která je mezi buňkami
- prosycení tkáňového bločku vypraného ve vodě postupně v koncentrátu želatiny při 37°C, pak se bloček schladí, želatina ztuhne a bloček se stvrdí ve formolu, krájí se na zmrazovacím mikrotomu
POSTUP:
1) tkáňové bločky fixujeme formolem, vypereme v tekoucí vodě – 24 hodin
2) prosycování 10% roztokem želatiny při teplotě 37°C – 2 – 4 hodiny
3) prosycování 20% roztokem želatiny při 37°C – 4 – 6 hodin
4) zalití bločku do 20% roztoku želatiny do kovové nebo papírové krabičky
5) želatinu necháme ztuhnout
6) tvrzení želatinových bločků ve 20% formolu – 24 hodin
7) praní želatinových bločků ve vodě a krájení na zmrazovacím mikrotomu
Příprava roztoku želatiny
Roztok 10% - 20% želatiny se připraví rozpuštěním odváženého množství želatiny; želatinu necháme 15 minut zbobtnat a pak rozpustíme ve vodní lázni nebo termostatu za účelem konzervace přidáme krystalek thymolu.
Zalévání do želatiny, princip a použití
Barvení zeleným trichromem
- přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu světlá zeleň – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – zeleně
Svalstvo – červeně
Zalévání do želatiny, princip a použití
- želatina je měkké zalévací médium rozpustné ve vodě
- používá se pro zalévání řídkých tkání, které chceme zpevnit, nebo pokud tkáň chceme uchovat delší dobu
- želatina vytěsní z tkáně vodu, která je mezi buňkami
- prosycení tkáňového bločku vypraného ve vodě postupně v koncentrátu želatiny při 37°C, pak se bloček schladí, želatina ztuhne a bloček se stvrdí ve formolu, krájí se na zmrazovacím mikrotomu
POSTUP:
1) tkáňové bločky fixujeme formolem, vypereme v tekoucí vodě – 24 hodin
2) prosycování 10% roztokem želatiny při teplotě 37°C – 2 – 4 hodiny
3) prosycování 20% roztokem želatiny při 37°C – 4 – 6 hodin
4) zalití bločku do 20% roztoku želatiny do kovové nebo papírové krabičky
5) želatinu necháme ztuhnout
6) tvrzení želatinových bločků ve 20% formolu – 24 hodin
7) praní želatinových bločků ve vodě a krájení na zmrazovacím mikrotomu
Příprava roztoku želatiny
Roztok 10% - 20% želatiny se připraví rozpuštěním odváženého množství želatiny; želatinu necháme 15 minut zbobtnat a pak rozpustíme ve vodní lázni nebo termostatu za účelem konzervace přidáme krystalek thymolu.
2. Barvení modrým trichromem. Odvodnění tkáňových bločků, ředění alkoholu
2. Barvení modrým trichromem.
Odvodnění tkáňových bločků, ředění alkoholu
Barvení modrým trichromem
- přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu anilinová modř – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – modře
Svalstvo – červeně
Odvodnění tkáňových bločků
Pokud tkáň zaléváme do médií nerozpustných ve vodě ( parafin, celoidin ), musíme po fixaci tkáň odvodnit, abychom ji mohli prosytit rozpouštědlem zalévacího média.
Provádí se řadou alkoholů o stoupající koncentraci
- první koncentrace závisí na druhu použité fixační tekutiny a na množství vody ve tkáni ( čím má tkáň vyšší obsah vody, tím nižší koncentraci volíme, aby nedošlo k svraštění tkáně )
- po Buenově tekutině můžeme použít maximálně 80 % alkohol, při vyšší koncentraci tkáň bobtná,
po Suse 90 % a po Pastelsově tekutině 100 % alkohol
stoupající řada alkoholů:
70% - 2 hodiny
80% - 4-6 hodin
96% - 6 hodin
100% - 3x 2 hodiny
Ředění alkoholu
Alkohol je dodáván do laboratoře většinou v koncentraci 96 %, nižší koncentraci dostaneme ředěním destilovanou vodou.Množství destilované vody a alkoholu se stanoví buď z tabulek nebo pomocí křížového pravidla ( vezmeme tolik mililitrů etanolu výchozí koncentrace, kolik je koncentrace žádaná a doplní se destilovanou vodou do tolika mililitrů, kolik je koncentrace výchozího alkoholu.
příklad:
- chceme připravit 70 % alkohol z alkoholu 96 %
- vezmeme 70 ml 96 % alkoholu a doplníme destilovanou vodou na 96 ml
Odvodnění tkáňových bločků, ředění alkoholu
Barvení modrým trichromem
- přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv - oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu anilinová modř – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – modře
Svalstvo – červeně
Odvodnění tkáňových bločků
Pokud tkáň zaléváme do médií nerozpustných ve vodě ( parafin, celoidin ), musíme po fixaci tkáň odvodnit, abychom ji mohli prosytit rozpouštědlem zalévacího média.
Provádí se řadou alkoholů o stoupající koncentraci
- první koncentrace závisí na druhu použité fixační tekutiny a na množství vody ve tkáni ( čím má tkáň vyšší obsah vody, tím nižší koncentraci volíme, aby nedošlo k svraštění tkáně )
- po Buenově tekutině můžeme použít maximálně 80 % alkohol, při vyšší koncentraci tkáň bobtná,
po Suse 90 % a po Pastelsově tekutině 100 % alkohol
stoupající řada alkoholů:
70% - 2 hodiny
80% - 4-6 hodin
96% - 6 hodin
100% - 3x 2 hodiny
Ředění alkoholu
Alkohol je dodáván do laboratoře většinou v koncentraci 96 %, nižší koncentraci dostaneme ředěním destilovanou vodou.Množství destilované vody a alkoholu se stanoví buď z tabulek nebo pomocí křížového pravidla ( vezmeme tolik mililitrů etanolu výchozí koncentrace, kolik je koncentrace žádaná a doplní se destilovanou vodou do tolika mililitrů, kolik je koncentrace výchozího alkoholu.
příklad:
- chceme připravit 70 % alkohol z alkoholu 96 %
- vezmeme 70 ml 96 % alkoholu a doplníme destilovanou vodou na 96 ml
1. Barvení hematoxylin – eosinem. Druhy hematoxylinu, jejich použití a způsoby barvení.
1. Barvení hematoxylin – eosinem. Druhy hematoxylinu,
jejich použití a způsoby barvení.
Barvení hematoxylin – eosinem
- základní barvící metoda
I. DEPARAFINACE
Xylen 1 – 5 minut
Xylen 2 – 5 minut
Alkohol 1 (100%) – 5minut
Alkohol 2 (96%) – 5 minut
Oplach ve vodě – 5 minut
II. VLASTNÍ BARVENÍ
1) kamencový hematoxylin – 3-10 minut
2) oplach v pramenité vodě
3) diferencování v kyselém alkoholu (na 100ml 96% alkoholu přidáme 3 – 5 kapek HCl) – hematoxylinem se obarví jádra, ale i zároveň se přibarví jiné složky tkáně např. vazivo, které odbarvujeme tzv. diferencováním v kys. alkoholu
4) modrání jader => praní v tekoucí vodě – 5 minut – zmodrání jader urychlíme vložením preparátu do 70% alkoholu případně vody s několika kapkami čpavku, oplach ve vodě
5) eosin 0,1% - 1-3 minut
6) oplach v dest. H2O
III. OVODNĚNÍ
Alkohol 1 – 1-3 minut
Alkohol 2 – 3-5 minut
Karbolxylen – 3-5 minut (lze nahradit acetone) = xylen nasycený kys. Karboxylovou =>dokončuje odvodnění
IV. PROJASNĚNÍ
Xylen 1 – 5 minut
Xylen 2 - 5minut
Řezy po projasnění xylenem musí být zcela průhledné, nesmí v nich zůstat bělavě zaklená místa; známka toho, že nebyly dobře odvodněny, pak preparáty musíme vrátit zpět do 100% alkoholu.
V. ZAMONTOVÁNÍ DO MONTOVACÍHO MÉDIA
Solakryl, kanadský balzám
Kapka montovacího média se kápne na krycí sklíčko; přebytečné médium se otře xylenem; řez nesmí při montování uschnout.
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra a chrupavka – modře
Svalstvo – červeně
Kolagenní vazivo – růžově
Druhy hematoxylinů, jejich použití a způsoby barvení
Samotný roztok hematoxylinu nebarví, nejprve se musí oxidovat v hematein a poté přidáním mořidla vzniká hematoxylinový lak, který má již schopnost barvit.
Podle mořidla, které hematoxylin obsahuje je dělíme na kamencové a železité
1. Kamencové hematoxyliny
- obsahují jako mořidlo kamenec
- mají modro-fialový tón
Harrisův hematoxylin
Roztok A: hematoxylin 5g, etanol 50 ml
Roztok B: vařící dest. H2O 1000 ml, síran hlinitoamonný
Smísíme roztok A a B a povaříme
Bömerův hematoxylin
Meierův hematoxylin
2. Železité hematoxyliny
jsou hnědé až černé
Weigertův hematoxylin
Roztok A: 1% hematoxylin v 96% alkoholu
Roztok B: dest. voda 95ml, chlorid železitý 0,6g, HCl 0,75ml
Roztok A + B se smísí v poměru 1:1
Hematoxylinovým lakem je možné barvit buď přímo, nebo tak, že nejprve prosytíme tkáň mořidlem a pak ji vložíme do roztoku hematoxylinu, takže se hematoxylinový lak vytvoří přímo ve tkáni
( toho se využívá např. při barvení Heidenhainovým hematoxylinem )
jejich použití a způsoby barvení.
Barvení hematoxylin – eosinem
- základní barvící metoda
I. DEPARAFINACE
Xylen 1 – 5 minut
Xylen 2 – 5 minut
Alkohol 1 (100%) – 5minut
Alkohol 2 (96%) – 5 minut
Oplach ve vodě – 5 minut
II. VLASTNÍ BARVENÍ
1) kamencový hematoxylin – 3-10 minut
2) oplach v pramenité vodě
3) diferencování v kyselém alkoholu (na 100ml 96% alkoholu přidáme 3 – 5 kapek HCl) – hematoxylinem se obarví jádra, ale i zároveň se přibarví jiné složky tkáně např. vazivo, které odbarvujeme tzv. diferencováním v kys. alkoholu
4) modrání jader => praní v tekoucí vodě – 5 minut – zmodrání jader urychlíme vložením preparátu do 70% alkoholu případně vody s několika kapkami čpavku, oplach ve vodě
5) eosin 0,1% - 1-3 minut
6) oplach v dest. H2O
III. OVODNĚNÍ
Alkohol 1 – 1-3 minut
Alkohol 2 – 3-5 minut
Karbolxylen – 3-5 minut (lze nahradit acetone) = xylen nasycený kys. Karboxylovou =>dokončuje odvodnění
IV. PROJASNĚNÍ
Xylen 1 – 5 minut
Xylen 2 - 5minut
Řezy po projasnění xylenem musí být zcela průhledné, nesmí v nich zůstat bělavě zaklená místa; známka toho, že nebyly dobře odvodněny, pak preparáty musíme vrátit zpět do 100% alkoholu.
V. ZAMONTOVÁNÍ DO MONTOVACÍHO MÉDIA
Solakryl, kanadský balzám
Kapka montovacího média se kápne na krycí sklíčko; přebytečné médium se otře xylenem; řez nesmí při montování uschnout.
VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra a chrupavka – modře
Svalstvo – červeně
Kolagenní vazivo – růžově
Druhy hematoxylinů, jejich použití a způsoby barvení
Samotný roztok hematoxylinu nebarví, nejprve se musí oxidovat v hematein a poté přidáním mořidla vzniká hematoxylinový lak, který má již schopnost barvit.
Podle mořidla, které hematoxylin obsahuje je dělíme na kamencové a železité
1. Kamencové hematoxyliny
- obsahují jako mořidlo kamenec
- mají modro-fialový tón
Harrisův hematoxylin
Roztok A: hematoxylin 5g, etanol 50 ml
Roztok B: vařící dest. H2O 1000 ml, síran hlinitoamonný
Smísíme roztok A a B a povaříme
Bömerův hematoxylin
Meierův hematoxylin
2. Železité hematoxyliny
jsou hnědé až černé
Weigertův hematoxylin
Roztok A: 1% hematoxylin v 96% alkoholu
Roztok B: dest. voda 95ml, chlorid železitý 0,6g, HCl 0,75ml
Roztok A + B se smísí v poměru 1:1
Hematoxylinovým lakem je možné barvit buď přímo, nebo tak, že nejprve prosytíme tkáň mořidlem a pak ji vložíme do roztoku hematoxylinu, takže se hematoxylinový lak vytvoří přímo ve tkáni
( toho se využívá např. při barvení Heidenhainovým hematoxylinem )
MATURITNÍ OTÁZKY PRO PRAKTICKOU ZKOUŠKU Z HISTOLOGIE A HISTOLOGICKÉ TECHNIKY
MATURITNÍ OTÁZKY PRO PRAKTICKOU ZKOUŠKU Z HISTOLOGIE A HISTOLOGICKÉ TECHNIKY
1.BARVENÍ HEMATOXYLIN-EOSINEM.DRUHY HEMATOXYLINŮ,JEJICH POUŽITÍ A ZPŮSOBY BARVENÍ
2.BARVENÍ MODRÝM TRICHROMEM.ODVODŇOVÁNÍ TKÁŇOVÝCH BLOČKŮ,ŘEDĚNÍ ALKOHOLU.
3.BARVENÍ ZELENÝM TRICHROMEM.ZALÉVÁN DO ŽELATINY,PRINCIP A POUŽITÍ.
4. BARVENÍ MODRÝM TRICHROMEM.ZALÉVÁNÍ DO CELOIDINU,POSTUP A POUŽITÍ.
5.BARVENÍ AZANEM.ZKVALITŇOVÁNÍ PARAFINU,PRINCIP DEPARAFINACE.
6. HEIDENHAINOVO BARVENÍ.ODBĚR MATERIÁLU PRO HISTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ.
7.BARVENÍ ORCEINEM.ZPRACOVÁNÍ TVRDÝCH TKÁNÍ PRO HISTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ.
8.PRŮKAZ NESPECIFICKÉ ESTERÁZY.ZPRACOVÁNÍ MATERIÁLU PRO PRŮKAZ ENZYMŮ.
9.PRŮKAZ ALKALICKÉ FOSFATÁZY.BAKEROVA TEKUTINA,PŘÍPRAVA A JEJÍ POUŽITÍ.
10.PRŮKAZ ŽÍHANÉHO LEMU RESORPČNÍHO EPITELU.PŘÍPRAVA A POUŽITÍ BOUINOVY TEKUTINY.
11.PAS REAKCE-PRINCIP, PROVEDENÍ A POUŽITÍ.PŘÍPRAVA BEZVODÉHO ALKOHOLU,ZKOUŠKY NA PŘÍTOMNOST VODY V ABSOLUTNÍM ALKOHOLU.
12.BARVENÍ ALCIÁNOVOU MODŘÍ.ZALÉVÁNÍ DO PARAFINU,PRINCIP A POUŽITÍ METODY.
13.PRŮKAZ GLYKOGENU.ZENKEROVA TEKUTINA,PŘÍPRAVA A POUŽÍITÍ.
14.GOMORIHO IMPRENACE.PŘÍPRAVA AMONIAKÁLNÍHO ROZTOKU STŘÍBRA.
15.PŘEHLED NEUROHISTOLOGICKÝCH METOD.PROVEDENÍ NISSLOVA BARVENÍ.
16.PRŮKAZ HLENU V POHÁRKOVÝCH BUŇKÁCH.SUSA-PŘÍPRAVA A POUŽITÍ.
17.NÁZORNĚNÍ MYELINOVÝCH POCHEV.BARVENÍ LUXOLOVOU MODŘÍ.
18.BARVENÍ WEIGERT VAN GIESONOVOU METODOU.PŘÍPRAVA A POUŽITÍ FIXAČNÍCH PROSTŘEDKŮ S FORMOLEM.
19.KRÁJENÍ PARAFINOVÝCH ŘEZŮ NA ROTAČNÍM MIKROTOMU.PRINCIP NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ PARAFINOVÝCH ŘEZŮ.
20. KRÁJENÍ,NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ PARAFINOVÝCH ŘEZŮ.ZALÉVACÍ MEDIA ROZPUSTNÁ VE VODĚ-PŘEHLED A POUŽITÍ.
21.ZNÁZORNĚNÍ MITOCHONDRIÍ.PŘEHLED A POUŽITÍ CYTOLOGICKÝCH METOD.
22.ZNÁZORNĚNÍ KOLAGENNÍCH VLÁKEN.PŘEHLED METOD Q PROVEDENÍ VYBRANÉ METODY.
23.ZNÁZORNĚNÍ ŽÍRNÝCH BUNĚK VE VAZIVU.ZALÉVACÍ MEDIA NEROZPUSTNÁ VE VODĚ.
24.MASSONOVY TRICHROMY.PROVEDENÍ BARVENÍ.
25.PRŮKAZ LIPIDŮ V JÁTRECH.MONTOVACÍ MEDIA A JEJICH VÝBĚR.
1.BARVENÍ HEMATOXYLIN-EOSINEM.DRUHY HEMATOXYLINŮ,JEJICH POUŽITÍ A ZPŮSOBY BARVENÍ
2.BARVENÍ MODRÝM TRICHROMEM.ODVODŇOVÁNÍ TKÁŇOVÝCH BLOČKŮ,ŘEDĚNÍ ALKOHOLU.
3.BARVENÍ ZELENÝM TRICHROMEM.ZALÉVÁN DO ŽELATINY,PRINCIP A POUŽITÍ.
4. BARVENÍ MODRÝM TRICHROMEM.ZALÉVÁNÍ DO CELOIDINU,POSTUP A POUŽITÍ.
5.BARVENÍ AZANEM.ZKVALITŇOVÁNÍ PARAFINU,PRINCIP DEPARAFINACE.
6. HEIDENHAINOVO BARVENÍ.ODBĚR MATERIÁLU PRO HISTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ.
7.BARVENÍ ORCEINEM.ZPRACOVÁNÍ TVRDÝCH TKÁNÍ PRO HISTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ.
8.PRŮKAZ NESPECIFICKÉ ESTERÁZY.ZPRACOVÁNÍ MATERIÁLU PRO PRŮKAZ ENZYMŮ.
9.PRŮKAZ ALKALICKÉ FOSFATÁZY.BAKEROVA TEKUTINA,PŘÍPRAVA A JEJÍ POUŽITÍ.
10.PRŮKAZ ŽÍHANÉHO LEMU RESORPČNÍHO EPITELU.PŘÍPRAVA A POUŽITÍ BOUINOVY TEKUTINY.
11.PAS REAKCE-PRINCIP, PROVEDENÍ A POUŽITÍ.PŘÍPRAVA BEZVODÉHO ALKOHOLU,ZKOUŠKY NA PŘÍTOMNOST VODY V ABSOLUTNÍM ALKOHOLU.
12.BARVENÍ ALCIÁNOVOU MODŘÍ.ZALÉVÁNÍ DO PARAFINU,PRINCIP A POUŽITÍ METODY.
13.PRŮKAZ GLYKOGENU.ZENKEROVA TEKUTINA,PŘÍPRAVA A POUŽÍITÍ.
14.GOMORIHO IMPRENACE.PŘÍPRAVA AMONIAKÁLNÍHO ROZTOKU STŘÍBRA.
15.PŘEHLED NEUROHISTOLOGICKÝCH METOD.PROVEDENÍ NISSLOVA BARVENÍ.
16.PRŮKAZ HLENU V POHÁRKOVÝCH BUŇKÁCH.SUSA-PŘÍPRAVA A POUŽITÍ.
17.NÁZORNĚNÍ MYELINOVÝCH POCHEV.BARVENÍ LUXOLOVOU MODŘÍ.
18.BARVENÍ WEIGERT VAN GIESONOVOU METODOU.PŘÍPRAVA A POUŽITÍ FIXAČNÍCH PROSTŘEDKŮ S FORMOLEM.
19.KRÁJENÍ PARAFINOVÝCH ŘEZŮ NA ROTAČNÍM MIKROTOMU.PRINCIP NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ PARAFINOVÝCH ŘEZŮ.
20. KRÁJENÍ,NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ PARAFINOVÝCH ŘEZŮ.ZALÉVACÍ MEDIA ROZPUSTNÁ VE VODĚ-PŘEHLED A POUŽITÍ.
21.ZNÁZORNĚNÍ MITOCHONDRIÍ.PŘEHLED A POUŽITÍ CYTOLOGICKÝCH METOD.
22.ZNÁZORNĚNÍ KOLAGENNÍCH VLÁKEN.PŘEHLED METOD Q PROVEDENÍ VYBRANÉ METODY.
23.ZNÁZORNĚNÍ ŽÍRNÝCH BUNĚK VE VAZIVU.ZALÉVACÍ MEDIA NEROZPUSTNÁ VE VODĚ.
24.MASSONOVY TRICHROMY.PROVEDENÍ BARVENÍ.
25.PRŮKAZ LIPIDŮ V JÁTRECH.MONTOVACÍ MEDIA A JEJICH VÝBĚR.
Přihlásit se k odběru:
Příspěvky (Atom)