9. Průkaz alkalické fosfatázy. Bakerova tekutina, příprava a její použití

9. Průkaz alkalické fosfatázy.
Bakerova tekutina, příprava a její použití

Průkaz alkalické fosfatázy
- k průkazu alkalické fosfatázy slouží azokopulační reakce
substrát – látka, se kterou enzym reaguje; sloučenina s naftalenem
enzym naftol
fosfát nebo acetát – vyskytuje se běžně v organismu, nemá smysl ho prokazovat
naftol + diazotovaná sůl -> azobarvivo (nerozpustné ve vodě)

PRINCIP: Působením enzymu se ze substrátu (sloučeniny naftolu) odštěpí naftol, který reaguje s diazoniovou solí (stabilizovaným diazotátem) vznikem barevné, ve vodě nerozpustné sraženiny - azobarviva. Výhodou této reakce je, že se naftoly v těle nevyskytují, proto je reakce specifická.

1) Deparafinace X1, X2, aceton1, aceton2 3 – 5 minut, oplach řezů v dest. vodě
2) Inkubace 20 – 30 minut při 37°C Inkubační roztok: veronalacetátový pufr pH 9,1 …1 díl 20ml substrát - alfa - naftil fosfát diazotovaná sůl FAST RED TR alfa smísit, přefiltrovat
3) Oplach v dest. vodě, hematoxylin 2 minuty, dobarvení jader pramenitou vodou
4) Montování do medií rozpustných ve vodě; pokud chceme řezy uchovat delší dobu je vhodná glycerinová želatina – tuhne při pokojové teplotě

VÝSLEDEK BARVENÍ
Hnědočervené azobarvivo vznikne v místě výskytu alkalické fosfatázy

VÝSKYT alkalické fosfatázy – žíhaný lem resorpčního epitelu (sliznice tenkého střeva, proximální tubulus ledvin)

Bakerova tekutina, příprava a její výskyt
Bakerova tekutina patří mezi formolové fixační tekutiny, je to 10 % formol obohacený o chlorid vápenatý. Používá se k fixaci tkání, ve kterých mají být prokazovány lipidy nebo enzymy.